人 IL-6 ELISA 试剂盒

所需设备及试剂
• 450 nm滤光片酶标仪，含540 nm或570nm校正波长更佳
•单道或多道微量移液器，移液器枪头
•去离子水
• 500 mL量筒
•样品稀释管或不同规格EP管
•吸水纸

一、样品收集和储存
1.细胞培养上清液：1000x g离心15分钟，取上清检测，或分装后于≤-20℃冰箱保存，避免样品反复
冻融。
2.血清样本：全血室温放置60分钟或4℃过夜，然后1000 x g离心15分钟，取上清检测，或分装后
于≤-20℃冰箱保存，避免样品反复冻融。
3.血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂收集血浆，样品采集后30分钟内1000 x g离心15分
钟，取上清检测，或分装后于≤-20℃冰箱保存，避免样品反复冻融。

二、试剂准备
使用前将所有试剂和标本置于室温平衡。
1.浓缩清洗液: 如果浓缩液中有晶体析出，加热至室温并轻轻混合，直到晶体完全溶解，25mL浓缩清洗液使用离子水定容至500mL，得到清洗工作液。
2.用0.5ml标准品稀释液溶解IL-6标准品冻干粉，溶解后标准品母液浓度为1600pg/mL。震荡混匀后静置10分钟，用移液枪取100μL 标准品母液至EP管中, 再取700μL标准品稀释液至EP管中，得到第一个标准点200pg/mL，依次进行倍比稀释操作得到共计7个标准点200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL、3.125pg/mL最后再以100ul标准品稀释液为零标准（0 pg/mL），共计8个标准点，建议每个标准点至少做2个平行孔。
3.检测溶液A（生物素标记），使用前震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心，使液体集中于管底，临用前取合适体积用检测溶液稀释液1:100稀释至工作浓度。
4.检测溶液B（HRP标记），使用前震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心，使液体集中于管底，临用前取合适体积用检测溶液稀释液1:2000稀释至工作浓度。
5.显色液: 避光保存，显色时100μL /孔。
6.终止液：显色完毕后50μL /孔。

三、使用前将所有试剂和样品置于室温。建议对所有标准品、对照品和样品进行一式两份的分析。
1.按照前面章节的指示准备所有试剂和准备工作。
2.从板架上取下多余的微孔板条，将其放回装有干燥剂包的箔袋中，然后重新密封保存于-20℃。
3.每孔加入100μL标准品或样品，用封板膜封住，37℃孵育60分钟。
4.弃去孔内液体，每孔加入 300μL的清洗液清洗，轻微震荡后弃去孔内液体，将酶标板倒扣在吸水纸
上轻拍，使残留在孔内的液体全部去除，重复洗板 3 次，此过程也可采用尖嘴喷射瓶，多道移液器
或自动洗板机来完成。
5.每孔加入100μL检测溶液A（生物素标记），用新的封板膜封住，37℃孵育30分钟。
6.重复步骤4中的洗板程序。
7.每孔加入100μL检测溶液B（HRP标记），用新的封板膜封住。37℃孵育30分钟。
8.重复步骤4中的洗板程序。
9.每孔加入100μL显色液，37℃避光显色10分钟。
10.每孔加入50μL终止液，孔里的颜色应该由蓝色变至黄色，如果孔内颜色为绿色或颜色变化不均匀，
轻轻震动酶标板板使颜色均一。
11.擦干酶标板底部水气，立刻用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度值（O.D.值），如果波长
校正可用，则设置为540 nm或570 nm，如果波长校正不可用，则从450 nm的读数中减去540 nm或
570 nm的读数，这种修正可去除酶标板读数中的光学偏差，如果没有校正波长，可直接读取450 nm
的读数，但读值有可能会更高、更不准确。

四、标准曲线制作
每个标准品和样品的复孔平均值O.D.，减去零标准孔平均值O.D.后，以标准品的浓度为纵坐标，O.D.值为横坐标，绘出标准曲线（R2值越趋近于1曲线越精确），然后再将样品的平均值O.D.带入标准曲线的回归方程式，计算出样品浓度。
如果样品已经稀释，从标准曲线上算出的浓度须乘以稀释系数，即为样品的实际浓度。

五、标曲案例
标准曲线仅用于演示， 每次实验均需生成单独的标准曲线。

六、检测范围
3.125pg/mL—200pg/mL

七、最低检测限(MDD)
0.5pg/mL
MDD是测试20个零标准（稀释液）的平均O.D.值上加两倍标准差后计算相应的浓度来确定的。

八、精密度
批内差： CV<12%
批间差： CV<15%

九、稳定性
试剂盒按推荐温度保存6个月，信号强度降低小于 10%。

十、回收率
分别于培养基，血清和血浆样本中加入低，中，高浓度的 IL6标准品，测定值与理论值的比率即为回收率。

十一、线性
分别于培养基，血清和血浆样本中加入一定量的 IL6标准品，使用稀释液倍比稀释成 1:2，1:4，1:8，1:16 的待测样本，稀释后样本中 IL6 含量的测定值与理论值的比率即为线性范围。

十二、实验细节说明
1.在试剂盒标签上的有效期内使用，不要与其他厂家的试剂盒混合使用。
2.如果样品检测值超出标准曲线范围，可使用适当的稀释液稀释样品并重新测定，或预估样品中IL6浓度，在实验之前预先稀释数个梯度同时进行测定。
3.为避免交叉污染，不同标准品、样品、试剂的加样需更换移液枪头，每管试剂使用单独的容器储存。
4.在孵育过程中贴紧封板膜。
5.显色液避光保存，临用前15分钟从冰箱取出在室温平衡。
6.浓缩清洗液（20×）需使用去离子水1：20稀释至工作浓度，去离子水不包含在试剂盒中，需实验人员自备。
7.终止液为酸性溶液，具有轻微腐蚀性，使用时避免接触皮肤、眼、耳、口等暴露部位，如不慎接触，使用大量清水冲洗后观察接触部位反应，如情节严重请及时就医。
8.试剂盒酶标板条可按需拆卸使用，已开封的试剂盒建议在1个月内使用，未开封的试剂盒以包装盒上保质期为准。

回收率

分别于培养基，血清和血浆样本中加入低，中，高浓度的 IL6标准品，测定值与理论值的比率即为回收率。

线性

分别于培养基，血清和血浆样本中加入一定量的 IL6标准品，使用稀释液倍比稀释成 1:2，1:4，1:8，1:16 的待测样本，稀释后样本中 IL6 含量的测定值与理论值的比率即为线性范围。

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