FITC Annexin V/PI Apoptosis Detection Kit

1.实验前准备

（1）1x磷酸缓冲液PBS；

（2）凋亡诱导剂；

（3）去离子水；

2.样品预处理

2.1 样品染色

（1）根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品，作为阴性对照。此外，进行流式检测时需取实验组分别进行Annexin V-FITC和PI单染，用于调节补偿；

（2）收集细胞。

  悬浮细胞：1000rpm、4℃离心5min，弃培养基上清；

  贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化细胞，终止消化后收集，1000rpm、4℃离心5min，弃上清；

（3）洗涤细胞。用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均在1000rpm、4℃离心5min，弃上清；

（4）配制1x Annexin V-binding buffer。用去离子水按照1:5体积比稀释5xAnnexin V-binding buffer备用；

（5）细胞重悬。加入100 μl 1x Annexin V-binding buffer，轻轻吹匀至单细胞悬液；

（6）细胞染色。加入5 μl Annexin V和5 μl PI Staining Solution，轻轻吹匀，置于室温避光孵育5-10min，再加入400 μl 1x Annexin V-binding buffer，轻轻混匀重悬。在1h内上流式细胞仪进行检测分析或荧光显微镜观察分析。 

2.2 样品分析

2.2.1 荧光显微镜分析

（1）将已染色重悬的细胞滴一滴在载破片上，并用盖破片盖上细胞；

  针对贴壁细胞可以直接接爬片让细胞直接生长在爬片上进行诱导及染色处理；

（2）置于荧光显微镜下用双色滤光片观察：Annexin-V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。

2.2.2 流式细胞仪分析

（1）流式细胞仪检测激发波长488nm，FITC的绿色荧光采集通道FL1通道检测；PI的红色荧光采集通道PI通道或FL2或FL3通道检测，建议使用FL3通道，每个样本采集10000个事件；

（2）荧光补偿调节。使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除广谱重叠与设定十字门的位置。在双色流式细胞散点图上，Annexin V-FITC与PI双阴性为正常细胞群，Annexin V-FITC阳性、PI阴性为早期凋亡细胞群，Annexin V-FITC与PI双阳性为晚期凋亡细胞或坏死细胞群。

3. 应用案例（流式细胞术检测喜树碱诱导Jurakt细胞凋亡）

分别用2.0、10 μM喜树碱（Camptothecin， CPT）诱导Jurkat细胞（人T淋巴瘤细胞株）4h收集细胞进行流式凋亡检测。参照产品说明书进行相关染色操作并用流式细胞仪进行凋亡检测，结果如下图。

（A）0μM对照组. （B）2.0μM实验组. （C）10μM实验组. 其中

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