本试剂盒基于中和 ELISA 分析技术,将 RBD(N501Y)蛋白预先包被在酶标板上,之后将阳性对照、阴性对照、分析样本分别加入到微孔中反应,再加入HRP标记的ACE2蛋白,样本中针对RBD(N501Y)的中和抗体会阻断RBD(N501Y)和ACE2之间的相互作用,清洗掉未结合的试剂,将显色底物溶液添加到微孔中显色,显色强度与样本中的RBD(N501Y)中和抗体浓度成反比。
所需设备及试剂
450 nm滤光片酶标仪,含540 nm或570nm校正波长更佳
单道或多道微量移液器,移液器枪头
去离子水
500 mL量筒
样品稀释管或不同规格EP管
吸水纸
样品收集与储存
处理所有的血液和血清,请按照NCCLS提供的处理和储存血清和血浆样本的建议(1990年H18-A批准的血液样本处理和处理标准程序)。
血清样本:全血室温放置60分钟或4℃过夜,然后1000 x g离心15分钟,取上清检测,或分装后于≤-20℃冰箱保存,避免样品反复冻融。
血浆:使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂收集血浆,样品采集后30分钟内1000 x g离心15分钟,取上清检测,或分装后于≤-20℃冰箱保存,避免样品反复冻融。
试剂准备
1. 20×浓缩清洗液:如果浓缩清洗液中有晶体析出,平衡至室温并摇匀,直到晶体完全溶解,25mL浓缩清洗液使用去离子水定容至500mL,得到清洗工作液。
2. 血清、血浆样本:推荐血清,血浆使用样本稀释液 1:10稀释后上样,例如10μL样本加入90μL样本稀释液。如果样本检测值超出检测范围,可适当调整稀释倍数并重新测定,或预估样本中抗体浓度,在实验之前预先稀释数个梯度同时进行测定。
3. 阳性对照工作液:阳性对照临用前震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心,使液体集中于管底,使用样本稀释液1:100稀释至工作浓度。
4. 阴性对照工作液:阴性对照临用前震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心,使液体集中于管底,使用样本稀释液1:10稀释至工作浓度。
5. 检测溶液A工作液:检测溶液A临用前震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心,使液体集中于管底,使用检测溶液稀释液1:2000稀释至工作浓度。
6. 显色液:避光保存,显色时100μL /孔。
7. 终止液:显色完毕后50μL /孔。
使用前将所有试剂和样本置于室温,建议对所有阳性对照、阴性对照和待测样本进行一式两份的分析。
1. 按照前面章节的指示准备所有试剂和样本。
2. 从板架上取下多余的微孔板条,将其放回装有干燥剂包的铝箔袋中,然后重新密封保存于-20℃。
3. 每孔分别加入50µL稀释好的阳性对照工作液,阴性对照工作液和待测样本,用封板膜盖好,37℃孵育30分钟。
4. 每孔分别加入50μL稀释好的检测溶液A工作液,用封板膜封住,使用微孔板振荡仪或手动轻微震荡5分钟后,37℃孵育1小时。
5. 弃去孔内液体,每孔加入 300μL的清洗工作液,轻微震荡后弃去孔内液体,将酶标板倒扣在吸水纸上轻拍,使残留在孔内的液体全部去除,重复洗板5次,此过程也可采用尖嘴喷射瓶,多道移液器或自动洗板机来完成。
6. 每孔加入100μL显色液,37℃避光显色10分钟。
7. 每孔加入50μL终止液,孔里的颜色应该由蓝色变至黄色,如果孔内颜色为绿色或颜色变化不均匀,轻轻震动酶标板使颜色均一。
8. 擦干酶标板底部水气,立刻用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的O.D.值,如果波长校正可用,则设置为540 nm或570 nm,如果波长校正不可用,则从450 nm的读数中减去540 nm或570 nm的读数,这种修正可去除酶标板读数中的光学偏差,如果没有校正波长,可直接读取450 nm的读数,但读值有可能不准确。
结果判读
为确保结果的有效性,阳性对照和阴性对照检测O.D.必须在下表所列的范围内,如果O.D.不符合下表要求,则实验无效,须重新进行测试。
项目 |
OD450值 |
结果判断 |
阳性对照 |
< 0.3 |
通过 |
阴性对照 |
>0.9 |
通过 |
用抑制率来判定样本中抗SARS-CoV-2中和抗体的水平,判定公式如下:
判定阈值
项目 |
阈值 |
结果 |
检测结果判读 |
中和抗体检测 |
≥20% |
阳性 |
检测到中和抗体 |
<20% |
阴性 |
未检测到中和抗体 |
精密度
批内差:CV<8%
批间差:CV<10%
稳定性
试剂盒按推荐温度保存6个月,信号强度降低小于 10%。
实验细节说明
1. 在试剂盒标签上的有效期内使用,不要与其他厂家的试剂盒混合使用。
2. 如果样本检测值超出检测范围,可适当调整稀释倍数并重新测定,或预估样本中RBD抗体浓度,在实验之前预先稀释数个梯度同时进行测定。
3. 为避免交叉污染,不同标准品、样本、试剂的加样需更换移液枪头,每管试剂使用单独的容器储存。
4. 在孵育过程中贴紧封板膜。
5. 显色液避光保存,临用前15分钟从冰箱取出室温平衡。
6. 浓缩清洗液(20×)需使用去离子水1:20稀释至工作浓度,去离子水不包含在试剂盒中,需实验人员自备。
7. 终止液为酸性溶液,具有轻微腐蚀性,使用时避免接触皮肤、眼、耳、口等暴露部位,如不慎接触,使用大量清水冲洗后观察接触部位反应,如情节严重请及时就医。
8. 试剂盒酶标板条可按需拆卸使用,已开封的试剂盒建议在1个月内使用,未开封的试剂盒所有试剂均按样品清单中推荐储存条件保存,收到试剂盒后请将阳性对照、阴性对照、检测溶液A以及预包板保存于-20℃,其余试剂请置于 4 ℃保存备用。
常见问题解决指南
问题 |
可能原因 |
解决方案 |
|
阳性质控读数低或者异常 |
检测溶液A和预包板失活 |
a. |
增加反应时间或检测试剂浓度以补偿可能丧失的活性 |
仪器设置错误 |
a. a.
|
检查仪器设置 |
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b. |
提前一小时预热酶标仪 |
||
加样错误 |
a. |
检查加样步骤 |
|
试剂过早提前准备 |
a. |
确保工作液现配现用 |
|
温度不稳定
|
a. |
孵育时间和温度参见说明书,避免反复冻融
|
|
读数背景高 |
样品中含有抑制剂
|
a. |
加入空白孔 |
b. |
保证DMSO < 1% |
||
洗涤不完全 |
a. |
增加洗涤次数和洗液量 |
|
缓冲液样品污染、降解
|
a. |
确保正确准备,使用和存储了缓冲液和样品
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|
读数不稳定 |
移液或稀释方法不一致 |
a. |
校正移液器
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b.
|
准备预混液以减少移液不一致 |
||
c. |
设置平行孔以获得更准确的结果 |
||
孔中有气泡 |
a. |
轻震酶标板以去除气泡
|
|
读数过高 |
a. |
调整样品浓度以达到最佳信号强度。
|
|
b. |
孵育时间调整至45分钟
|
||
试剂和样品混合不充分 |
a. |
确保试剂与样品完全混合
|
|
显色不完全 |
缓冲液残留或污染
|
a. |
阴性对照中的颜色应在添加TMB底物后10秒钟内出现。 如未按上述时间显色可考虑以下情况: a.在添加TMB之前确保没有污染或残留的缓冲液 b.延长TMB孵育时间到15分钟 |
样品名称 |
规格 |
描述 |
推荐储存条件 |
预包板 |
1 板 |
96孔聚苯乙烯微孔板(12列*8孔),预包被RBD(N501Y)蛋白。 |
密封状态放置于-20℃保存。 |
阳性对照 |
1 管 |
12μL /管阳性对照,临用前用样本稀释液1:100 稀释至工作浓度。 |
放置于-20℃保存。 |
阴性对照 |
1 管 |
60μL /管阴性对照,临用前用样本稀释液1:10 稀释至工作浓度。 |
放置于-20℃保存。 |
检测溶液A
|
1 管 |
12μL/管-HRP标记 ACE2 蛋白(含防腐剂),临用前用检测溶液稀释液1:2000稀释至工作浓度。 |
放置于-20℃保存。 |
样本稀释液 |
1 瓶 |
25 mL稀释液(含防腐剂),用于待测样本的稀释。 |
放置于4℃保存。 |
检测溶液稀释液 |
1 瓶 |
25 mL稀释液(含防腐剂),用于检测溶液A的稀释。 |
放置于4℃保存。 |
浓缩清洗液 |
1 瓶 |
25 mL (20×)浓缩清洗液(含防腐剂),临用前用去离子水1:20稀释至工作浓度。 |
放置于4℃保存。 |
显色液 |
1 瓶 |
12 mL TMB(四甲基联苯胺)。 |
放置于4℃保存。 |
终止液 |
1 瓶 |
6 mL 。 |
放置于4℃保存。 |
封板膜 |
3 片 |
用于实验中封闭酶标板。 |
放置于常温保存。 |
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质量与免责说明:
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