2019-nCoV Nucleocapsid Protein检测试剂盒

所需设备及试剂

450 nm滤光片酶标仪，含540 nm或570nm校正波长更佳

单道或多道微量移液器，移液器枪头

去离子水

500 mL量筒

样品稀释管或不同规格EP管

吸水纸

 试剂准备

使用前将所有试剂和样本置于室温平衡。

1. 20×浓缩清洗液： 如果浓缩液中有晶体析出，加热至室温并轻轻混合，直到晶体完全溶解，25mL 浓缩清洗液使用去离子水定容至 500mL，得到清洗工作液。

2. 标准品：用 1mL 样本稀释液溶解 Nucleocapsid Protein 标准品冻干粉，溶解后标准品母液浓度为 20ng/mL。震荡混匀后静置 10 分钟，然后进行标准品的稀释，将标准品母液使用样本稀释液依次 进行倍比稀释操作得到共计 7 个标准点 20ng/mL、 10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、 0.625ng/mL、0.3125ng/mL、最后再以 100ul 样本稀释液为零标准（0 ng/mL），共计 8 个标准点， 建议每个标准点至少做 2 个平行孔。

3. 检测溶液 A（生物素标记）：震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心，使液体集中于管底，临用前取 合适体积用检测溶液稀释液 1:2000 稀释至工作浓度。

4. 检测溶液 B（HRP 标记）：震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心，使液体集中于管底，临用前取合 适体积用检测溶液稀释液 1:2000 稀释至工作浓度。

5. 显色液: 避光保存，显色时 100μL /孔。

6. 终止液：显色完毕后 50μL /孔。

使用前将所有试剂和样本置于室温，建议对所有标准品和样本进行一式两份的分析

1. 按照前面章节的指示准备所有试剂和准备工作。

2. 从板架上取下多余的微孔板条，将其放回装有干燥剂包的箔袋中，然后重新密封保存于-20℃。

3. 每孔加入 100μL 稀释好的标准品（共计 8 点）和待测样本，用封板膜封住，37℃孵育 60 分钟。

4. 弃去孔内液体，每孔加入 300μL 的清洗工作液，轻微震荡后弃去孔内液体，将酶标板倒扣在吸水 纸上轻拍，使残留在孔内的液体全部去除，重复洗板 3 次，此过程也可采用尖嘴喷射瓶，多道移液 器或自动洗板机来完成。

5. 每孔加入 100μL 检测溶液 A 工作液（生物素标记），用新的封板膜封住，37℃孵育 60 分钟。

6. 重复步骤 4 中的洗板程序。

7. 每孔加入 100μL 检测溶液 B 工作液（HRP 标记），用新的封板膜封住，37℃孵育 30 分钟。

8. 重复步骤 4 中的洗板程序。 9. 每孔加入 100μL 显色液，室温避光显色 10 分钟。

10. 每孔加入 50μL 终止液，孔里的颜色应该由蓝色变至黄色，如果孔内颜色为绿色或颜色变化不均匀， 轻轻震动酶标板板使颜色均一。

11. 擦干酶标板底部水气，立刻用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度值（O.D.值），如果波长 校正可用，则设置为 540 nm 或 570 nm，如果波长校正不可用，则从 450 nm 的读数中减去 540 nm 或 570 nm 的读数，这种修正可去除酶标板读数中的光学偏差，如果没有校正波长，可直接读取 450 nm 的读数，但读值有可能会更高、更不准确。

标准曲线制作

取每个标准品和样本的复孔平均值 O.D.，减去零标准孔平均值 O.D.后，以标准品的浓度为横坐标，O.D. 值为纵坐标，绘出标准曲线（R ²

值越趋近于 1 曲线越精确），然后再将样本的平均值 O.D.带入标准曲 线的回归方程式，计算出样本中目标蛋白浓度。

如果样本已经稀释，从标准曲线上算出的浓度须乘以稀释系数，即为样本中目标蛋白的实际浓度。

标曲案例

标准曲线仅用于演示，每次实验均需生成单独的标准曲线。

检测范围

1.25ng/mL—20ng/mL

最低检测限(MDD)

<1ng/mL

MDD 是测试 20 个零标准（稀释液）的平均 O.D.值上加两倍标准差后计算相应的浓度来确定的。

精密度

批内差： CV<12%

批间差： CV<15%

稳定性

试剂盒按推荐温度保存 6 个月，信号强度降低小于 10%。

实验细节说明

1. 在试剂盒标签上的有效期内使用，不要与其他厂家的试剂盒混合使用。

2. 如果样本检测值超出标准曲线范围，可适当调整稀释倍数并重新测定，或预估样本中蛋白浓度，在 实验之前预先稀释数个梯度同时进行测定。

3. 为避免交叉污染，不同标准品、样本、试剂的加样需更换移液枪头，每管试剂使用单独的容器储存。

4. 在孵育过程中贴紧封板膜。

5. 显色液避光保存，临用前 15 分钟从冰箱取出在室温平衡。

6. 浓缩清洗液（20×）需使用去离子水 1：20 稀释至工作浓度，去离子水不包含在试剂盒中，需实验 人员自备。

7. 终止液为酸性溶液，具有轻微腐蚀性，使用时避免接触皮肤、眼、耳、口等暴露部位，如不慎接触， 使用大量清水冲洗后观察接触部位反应，如情节严重请及时就医。

8. 试剂盒酶标板条可按需拆卸使用，已开封的试剂盒建议在 1 个月内使用，未开封的试剂盒所有试剂 均按试剂瓶标签上所示保存，收到试剂盒后请将标准品、检测溶液 A、检测溶液 B、以及预包板保 存于-20℃，其余试剂请置于 4 ℃保存备用。

常见问题解决指南

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