1.产品介绍
无缝克隆是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技术,可以同时将多个DNA片段克隆到任何载体中,并且最终构建的克隆没有任何额外的碱基序列,因此被称作“无缝克隆”。
和传统的基因克隆方法相比,本试剂盒的无缝克隆技术有多方面的优势:(1)操作更简单,只需要一次反应即可完成;(2)对酶切位点无要求,可以把目的片段插入到任意载体的任意位点;(3)连接片段之间不会引入任何多余的序列,是真正的无缝克隆;(4)阳性克隆率高,降低克隆筛选的工作量。
本试剂盒操作简单,仅需将载体在插入位点进行线性化,同时将目的片段两端引物与载体插入位点同源的15-25bp序列,将线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按合适比例混合,并加入2×Master Mix,在重组酶的催化下,50℃反应30min即可快速完成定向克隆,阳性率高达90%以上。试剂盒中2×Master Mix预混了DNA外切酶、DNA聚合酶、连接酶和重组反应所需缓冲液,并添加了特殊的酶激活组分,可显著提高重组克隆效率,可以一次实现多至3-6个片段的顺序拼接克隆。
2.试剂盒原理示意图
图1. 无缝克隆试剂盒原理示意图 。 单酶切/双酶切获得线性化载体。扩增与载体带有同源臂的目的片段(蓝色和红色部分为同源部分)。按一定的比例将二者混合在2×Master Mix预混液中,50℃反应30min后直接转化E.coli即可。
1.线性化载体的制备
线性化载体制备的两种方法:
(1)在目标载体质粒上选取合适的位点,进行单酶切或者双酶切,酶切后割胶纯化;
(2)反向PCR扩增载体,在线性化位点设计一对互补的引物,进行扩增。
注意:载体质粒单酶切容易造成载体切割不完全和载体自连,导致假阳性的产生,所以尽可能的选择双酶切。请务必割胶回收线性化的载体,否则残余的环状质粒会产生背景菌落。一般回收后的线性化载体浓度需要>15ng/µl。
2. 目的基因片段的制备
设计引物进行目的片段的扩增:
(1)PCR引物必须包含两个部分,引物的5"端必须包含与载体末端完全同源的15-25bp碱基,引物的3’端必须包含靶基因特意引物序列。
(2)每条引物的3’端必须具有目的基因特异性,长度为15-25bp,GC%为40%-60%,退火温度Tm为58℃-65℃。PCR产物经跑胶,割胶纯化待用。
(3)当有多个片段插入时,首片段和末尾片段引物的5"端必须包含与载体末端完全同源的15-25bp碱基。其余中间片段引物的5"端必须包含与前一个片段15bp左右同源序列,3"端必须包含与后一个片段15bp左右同源序列。
图3.目的片段引物设计示意图
3.反应体系的设置
参考下表在冰上配制重组反应体系:
2 ×Master Mix | 5 µl |
Linearized vector | 50-200ng |
Purified PCR Fragment | 20-200ng |
Total | 10 µl |
反应条件:插入单个片段,一般需50℃反应30min;随着插入片段的增多,长度的加大,反应时间随之延长,一般需要45-60min。
注意:线性化载体与目的片段的加入量可以根据各自的浓度,片段的长度自行调整。目的片段与线性化载体的摩尔比在3:1左右,过高或过低都会降低重组效率。
4.转化及阳性克隆的鉴定
(1)取100μl待转化感受态,置于冰上解冻。
(2)向上述感受态细胞悬浮液中加入10μl重组好的反应液(按第3步操作),轻轻混匀,不能震荡,将该混合物置于冰上30 min。
(3)在42℃的水浴中热激90 sec,立即置于冰上保存2 min,再加入500 μl LB培养基(不含抗性),37 ℃摇床200rpm震荡培养1h左右。
(4)取上述转化混合液200-300μl,涂布在选择性固体培养基上(含相应抗生素),待菌液被培养基充分吸收后,将平板倒置于37 ℃恒温培养箱中培养过夜。
(5)挑平板上的克隆进行菌落PCR,或提质粒双酶切鉴定阳性克隆。
转化后平板上不长克隆或者克隆数很少?
1.方案设计有问题。片段引物的设计必须带有与载体同源序列。
2.平板抗性有误。抗性不对或者抗生素浓度高于使用浓度。
3.纯化回收的线性化载体以及目的基因片段有问题。建议跑胶验证浓度,看是否有大小正确的条带以及亮度如何。
4.感受态效率低:建议使用高效率的感受态,每次实验可设置一组转化质粒的实验作为阳性对照组,以检测感受态的转化效率。
转化后平板上长满克隆,导致不能挑单克隆?
1.平板放置时间过久,抗性减少或消失。建议重新配置新鲜LB平板。
2.载体线性化不彻底。可以设置转化线性化质粒的实验作为对照组,若能在对应抗性平板上长出克隆,则线性化不完全。即使只有0.1ng环状质粒残留,转化后,平板上也会长出上百颗克隆。建议增大内切酶的用量,降低载体质粒的酶切用量,延长跑胶时间,尽量使酶切后的条带与环状质粒分离彻底,再割胶回收线性化载体。
3.感受态用量过多,载体及目的片段浓度过大。假如感受态效率较高,可以减少感受态的用量,100μl改用50μl;载体以及片段浓度高,可以适当减少二者的用量。
4.判断是否感染杂菌,对所用试剂、操作环境严格消毒。
鉴定结果假阳性偏多?
1.PCR产物中含有非特异性片段,此时需要优化PCR反应条件,或割胶回收目的片段,提高产物纯度。
2.载体线性化不彻底,导致菌落PCR检测出来的是空载体。
3.为避免假阳性结果,我们建议菌落PCR的引物,可以一条为载体特异性引物(PUC19-F/PUC19-R),另一条引物为扩增目的片段的特异性引物,这样可以大大降低假阳性的出现。
鉴定有阳性,但是测序插入的不是目的基因?
1.引物的特异性不强,扩增到的不是目的基因,建议重新设计引物;
2.PCR的模板质粒用量过多,PCR产物中含有模板质粒,一起转化后长出的克隆,也会检测出大小相近的条带,出现隐性的假阳性;
3.使用重组质粒进行双酶切获得线性化载体时,载体质粒双酶切不彻底,重组质粒转化长出的克隆,检测出来是重组质粒的插入基因,而这个大小又恰好与目的基因大小接近,这时候也会出现隐性的假阳性,只能通过测序结果来判断。所以建议使用空载体进行双酶切获得线性化载体。
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