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TUNEL细胞凋亡试剂盒(Fluorescein-12)

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概述(Summary)icon
产品英文名(Product Name)
TUNEL Apoptosis Detection Kit(Fluorescein-12)
产品中文名
TUNEL细胞凋亡试剂盒(Fluorescein-12)
产品描述(Description)
细胞凋亡是细胞的一种基本的生物学现象,如核质固缩,线粒体膜电位消失,通透性改变,细胞间连接消失,DNA降解等。细胞在凋亡发生时,会激活一些相关内切酶类,这些酶会切断核小体间的基因组DNA,这种特异且有规律的DNA降解在经DNA电泳检测时,则会呈现180-200bp的DNA梯度条带,而坏死的细胞DNA则呈弥散性条带。TUNEL(rTdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理,即基因组DNA断裂时,暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Recombinant Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, rTdT)的催化下加上绿色荧光素标记的FITC-12-dUTP,从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。
本公司生产的TUNEL细胞凋亡试剂盒(Fluorescein-12)是一款灵敏性高,可检测到单细胞水平的凋亡现象,同时可检测到早期凋亡;快速简便,只需将固定好的细胞或组织经染色及洗涤后,即可置于荧光显微镜或者流式细胞仪下进行检测,整个实验操作仅需1-2小时。另外,本试剂盒应用范围广泛,不仅可用于冰冻切片和石蜡切片的凋亡检测,还可用于贴壁或悬浮细胞的凋亡检测。
储存条件(Storage)
储存于-25 ~ -15℃, Fluorescein-12-dUTP Nucleotide Mix避光保存于-20 ºC。
运输方式(Shipping)
冰袋运输。
Note
For research use only .
使用方法(Standard Operating Procedure)icon

1.实验前准备
(1)磷酸缓冲液PBS;
(2)溶于PBS的4%多聚甲醛固定液,pH7.4;
(3)溶于PBS的0.1% Triton X-100;
(4)如需染核,需备DAPI(2 μg/ml)或PI(1 μg/ml);
(5)如需设置阳性对照组,需备DNase I Buffer及DNase I;
(6)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2.样品预处理
2.1 细胞样品
(1)细胞爬片或者涂片经PBS洗涤5分钟后,用溶于PBS的4%多聚甲醛液室温固定30分钟;
(2)PBS洗涤5分钟;
(3)用含0.1% Triton ® X-100的PBS溶液,37℃湿盒通透10-15分钟;
(4)PBS洗涤3次,每次5分钟;
注意:细胞涂片要做好方脱处理。
2.2 组织切片
2.2.1 石蜡切片
(1)室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中脱蜡10-20分钟,换用新鲜的二甲苯再脱蜡10-20分钟,重复1-2次;
(2)室温下用100%乙醇浸泡切片5分钟,重复2次;
(3)室温下用梯度乙醇(95%、80%、70%)各浸泡切片1次,每次5分钟;
(3)PBS浸泡、洗涤5分钟;
注意:在实验过程中,切勿让样品干燥,处理好的样本放在湿盒中保持湿润。
(4)配制Proteinase K工作液:按1:9体积比,用PBS作为稀释液,至终浓度为0.2 μg/μl;
(5)每个样本上滴加100 μl Proteinase K工作液覆盖样本,37℃湿盒通透15-20分钟;
注意:Proteinase K帮助组织和细胞进行染色剂的通透,孵育时间过长会导致组织或细胞从切片上脱落,过短则造成通透性处理不充分影响后续标记效率。为得到更好的结果,可以优化Proteinase K的孵育时间。
(6)PBS洗涤3次,每次5分钟;处理后样本放置在湿盒中保持样本湿润。
注意:这一步必须把蛋白酶K洗涤干净,否则会严重干扰后续的标记反应。
2.2.2 冰冻切片
(1)将玻片短暂回温后浸没在溶于PBS的4%多聚甲醛溶液中,室温孵育30分钟。
(2)玻片从固定液中取出后,置于通风橱中自然晾干;
(3)将玻片放入纯水或PBS浸泡、洗涤3-5分钟;
(4)每个样本上滴加100 μl Proteinase K工作液覆盖样本,37℃湿盒通透15-20分钟;
(5)PBS洗涤3次,每次5分钟;处理后样本放置在湿盒中保持样本湿润。
3. 阳性样本和阴性样本的处理(可选)
(1)阳性对照组:加入10 U/ml的DNase I;
(2)阴性对照组:加入等体积1× DNase I Buffer;
(3)所有分组均加入1×DNase I Buffer并完全覆盖样本表面,37℃湿盒孵育30分钟。
(4)去掉多余的液体并将玻片用去离子水彻底洗涤3-4次。
4. 染色标记
TUNEL检测液配置表:

试剂组分

实验组

阳性对照组

阴性对照组

1x Equilibration Buffer

42μl

42μl

42μl

Fluorescein-12-dUTP Nucleotide Mix

3μl

3μl

3μl

Recombinant TdT Enzyme

5μl

5μl

-

ddH2O

-

-

5μl

注意:TUNEL检测液需现配现用,避免反复冻融。
(1)按1:9的比例,用ddH2O稀释10x Equilibration Buffer为1x Equilibration Buffer,备用;
(2)按照表格比例配置TUNEL检测液,每组切片滴加适量的TUNEL检测液使其完全覆盖(针对涂片、切片或者96孔板,48孔板、24孔板及12孔板,一般50μl TUNEL检测液可足够用于大小约为2.5*2.5cm的样本),注意不能干片且要避光;
(3)将玻片置于37℃湿盒避光孵育1-2h;注意孵育过程不要干片;
(4)立即用PBS溶液润洗3-4次,每次5分钟;
(5)在黑暗环境中将玻片浸入PI溶液(1μg/ml)的染色缸或DAPI溶液(2μg/ml),室温放置8分钟(可选);
(6)用PBS清洗玻片3次,每次5分钟;
(7)用滤纸吸净玻片多余液体,用抗荧光猝灭封片剂封片。
注意:封片前可向样本区域加100μl含有抗荧光淬灭剂、20%甘油的PBS保持样本湿润。
5. 观察检测
荧光显微镜下观察,注意避光。PI/DAPI能将凋亡/未凋亡的细胞都染成红色/蓝色,只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位绿色荧光。
6. 流式细胞术检测悬浮细胞
(1)将3.0-5.0×10 6个细胞用PBS洗2次,每次4℃,1500rpm离心10分钟;
(2)用0.5 ml PBS重悬细胞;
(3)固定细胞:加入溶于PBS的4%多聚甲醛固定液1 ml,冰上放置30分钟;
(4)4℃,1500rpm离心5分钟,去上清;
(5)1 ml PBS重悬细胞,4℃,1500rpm离心5分钟,去上清并用0.5 ml PBS重悬;
(6)用1 ml含0.1% Triton ® X-100的PBS溶液通透细胞或用0.2μg/μl的protein k溶液工作液通透细胞,室温放置5分钟;
(7)1500rpm离心5分钟,弃上清,用1 ml PBS重悬细胞;
(8)转移细胞至一个新的1.5 ml微量离心管,1500rpm离心5分钟,去上清;
(9)用80 μl 1x Equilibration Buffer重悬,室温孵育30分钟;
(10)1500rpm离心10分钟,去上清;
(11)将细胞沉淀重悬在50 μl TUNEL检测液(参照TUNEL检测液配置表),37℃避光孵育1-2h,每隔15min用微量移液器轻轻重悬细胞;
(12)反应完成后加入1 ml 20mM EDTA终止反应,用微量移液器轻轻混匀;
(13)1500rpm离心10分钟,去上清并把细胞沉淀用0.5 ml PI溶液(1μg/ml)重悬,避光孵育30分钟;
(14)流式细胞仪分析细胞。 测量495-520nm波段Fluorescein-12-dUTP的绿色荧光和>620 nm波段PI的红色荧光。
7.常见问题及注意事项
(1) 荧光高背景
1.FITC被非特异性掺入,整个操作过程需保证样品的湿润;
2.高速分裂或增殖的细胞,有时也会出现细胞核DNA断裂;
3.TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的rTdT酶稀释液稀释rTdT酶2-5倍后再操作。稀释后的rTdT酶需当日使用完毕;
4.支原体污染。利用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染;
(2) 荧光信号弱
1.Triton X-100通透或者蛋白酶K作用不充分,可调整通透剂的浓度和孵育时间;
2.荧光淬灭,荧光剂需避光保存和使用;
3.由于凋亡细胞贴壁性减弱,因此在操作过程中应轻柔操作避免细胞丢失;
(3)出现非特异性标记
1.有些细胞和组织里的DNA酶活性比较高,易导致非特异性标记。解决办法是取完细胞或组织后立即对其进行充分固定,阻止酶活;
2.操作过程中可能混入DNA酶的污染。

组分&说明(Component & Instruction)icon

组分

ATK00001-20T

ATK00001-50T

ATK00001-100T

10x Equilibration Buffer

1.5ml

1.5ml x2

1.5ml x4

Fluorescein -12-dUTP Nucleotide Mix

60μl

150μl

300μl

Recombinant TdT Enzyme

100μl

250μl

500μl

10× Proteinase K2 mg/ml)

100μl

250μl

500μl

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