His-Tag蛋白纯化原理_步骤_常见问题

2017-12-28 16:09:07

983 admin

His-Tag是重组蛋白表达最常用的标签,无论表达的蛋白是可溶的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和层析(IMAC)纯化。

his-tag优势

 His-Tag非常小,对蛋白的下游应用无影响

 N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容,有利于蛋白表达

采用IMAC(固定化金属离子亲合层析)纯化His-Tag融合蛋白操作更加简便

 His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响,不会形成二聚体

His-Tag的免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体

与其它亲和标签构建成双亲和标签,并可应用于多种表达系统

His-Tag蛋白纯化原理组氨酸(His)的残基上带有1个咪唑基团,可以和Ni2+Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上,这些金属离子能够用鳌合配体固定在层析介质上,因此带有his标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性的结合在介质上,而其他的杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱,从而得到较高纯度的 His 标签蛋白。

Ni2+在亲和纯化实验中的使用最为广泛。根据结合基团的不同,Ni2+亲和层析柱可分为Ni-IDA和Ni-NTA。NTA的颗粒粒度均匀,粒径更小,并且螯合镍更稳定,能耐受较高的还原剂,使填料更加稳定,镍离子不易脱落,因此选择Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化。

Ni-NTA亲和层析实验

Ni-NTA分离带His标签的重组蛋白具体操作

1. Ni-NTA装柱,1.6×20cm,柱床体积为10mL;

2. 用缓冲液1平衡2~5个床体积,流速为2mL/min;

3. 将20mL细胞破碎液(50mMPBS,pH7.4,0.5MNaCl)0.45µm滤膜过滤,上样,流速为1mL/min;

4. 用缓冲液1再洗2~5个床体积,流速为2mL/min;

5. 用分别含10、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱,流速为2mL/min,收集各阶段洗脱峰,用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度;

6. 用纯水流洗5个柱床体积,再用20%的乙醇流洗3个柱床体积,流速为2mL/min,柱子置于低温环境中保存。

几种缓冲液组成

缓冲液1

50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制:0.5M NaH2PO4 19mL,0.5M Na2HPO4 81mL,NaCl 29.3g,加适量水溶解后定容到1000mL。

缓冲液2

50mM磷酸盐缓冲液,pH7.4,即pH7.4的PBS溶液。配制:0.5M NaH2PO4 19mL,0.5M Na2HPO4 81mL,NaCl 29.3g和咪唑34g,加适量水,调pH后定容到1000mL。

缓冲液3

不同咪唑浓度的缓冲液3配制:

咪唑浓度

缓冲液1量(mL)

缓冲液2量(mL)

10mM

98

2

50mM

90

10

100mM

80

20

200mM

60

40

300mM

40

60

400mM

20

80


His标签蛋白纯化常见问题及解决办法

1蛋白不挂柱

① 超声的功率不对(太大,蛋白炭化,太小,蛋白没有释放);

策略:改变超声功率,并在超声前加入溶菌酶。

② 样品或者是结合缓冲液不正确;

策略:检测pH及样品和结合缓冲液的组成份(EDTA)。

③ 组氨酸的标签没有完全的暴露;

策略:在变性条件下(用8M脲,6M盐酸胍,1%SDS)并加入1-2mMDTT进行纯化。

④ His标签丢失;

策略1:WB或者anti-his的抗体检查His是否表达,上游构建,改变his-tag的位(C-terminalor N-terminal),必要时增加his个数(常用6-10个);

策略2:孵育的时间不够,降低流速和增加孵育的时间;

策略3:改变螯合的金属离子,寻找到最佳的结合金属离子,可以利用HitrapIMACHP来筛选不同的金属离子。


2蛋白挂柱后洗脱不下来

① 洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上,结合力较强) 策略:用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。

② 蛋白和柱子有其他非特异的吸附

策略:加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如,2%Triton X-100)或增加NaCl 的浓度。

③ 蛋白已沉淀在柱上

策略:减少上样量和孵育的时间,试用去污剂(1%-2%Tritonx-100)或改变NaCl 的浓度,或在变性条件下洗脱(用8M 脲,或6M 盐酸胍),最终也可在洗脱Buffer 中加入2mMDTT 或0.5%肌氨酸钠进行洗脱。


3纯化过程中蛋白变浑浊

出现浑浊,说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定

策略:检查缓冲体系是否正确,环境是否低温,或在缓冲液中加入还原剂DTT。加入肌氨酸钠,迅速使蛋白变性,消除浑浊现象。


4杂带比较多

① 如果纯化的是上清,蛋白酶会部分降解目的蛋白

策略:可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。

② 杂蛋白与镍柱的亲和力太强

策略:提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度。

③ 杂蛋白和目的蛋白结合

策略:可通过超声前加入去垢剂的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。


5蛋白纯度不够

① 优化过渡金属离子种类

纯度不够的主要原因是宿主细胞蛋白中的一些含有组氨酸的杂蛋白吸附在鏊合介质上。因此,可以采用螯合能力弱的Co2+作为过渡金属离子,使得含有组氨酸的杂蛋白无法吸附在介质上,从而提高目标蛋白的纯度。

② 多步纯化

在金属螯合层析之后,根据蛋白分子量大小和带电荷情况,加一步凝胶过滤层析或者离子交换层析,尝试将目标蛋白与杂质进一步分离开来,提高目标蛋白纯度。

③ 双标签纯化

StrepII也是一个长度较小(8个氨基酸)的标签,可以在重组蛋白上同时添加His标签合StrepII标签。

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