免疫沉淀常见问题及解决方案

2017-12-22 14:40:43

520 admin

免疫沉淀技术可以与基因组技术、放射同位素技术、聚合酶链式反应、免疫印迹等实验方法相结合,对较复杂的蛋白质与DNA/RNA的关系和定位提供非常好的解决方法。

这几种方法的区别:

种类

研究对象

结合技术

染色质免疫沉淀(CHIP)

DNA-蛋白质

PCR

蛋白质免疫沉淀(PIP)

抗原-抗体

蛋白免疫印迹

放射免疫沉淀(RIP)

抗原-抗体

放射性同位素技术

免疫沉淀技术,再结合其他技术还可以衍生出更多的技术,先来一下染色质免疫沉淀(CHIP)。

一、染色质免疫沉淀CHIP):

染色质免疫沉淀 (ChIP) 是研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。

原理在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。后期通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

应用:ChIP可以用来检测体内反式作用因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,ChIP与其他方法的结合扩大了其应用范围:ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;ChIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。


CHIP操作步骤:

  1. 甲醛处理细胞

  2. 收集细胞,超声破碎

  3. 加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合

  4. 加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,沉淀

  5. 对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合

  6. 洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物

  7. 解交联,纯化富集的DNA-片断

  8. PCR或基因芯片分析


二、免疫沉淀常见问题和解决方案:

1 WB结果背景高且不均匀

原因

方案

洗涤不充分

离心前盖上管盖反复颠倒几次

抗体浓度太高

检查推荐抗体用量,尝试使用更少的抗体

抗体特异性不够

使用亲和纯化的抗体,最好预先吸收

封闭不充分

优化封闭时间/温度,室温封闭1小时或4℃封闭过夜

封闭液中与其他蛋白发生抗体的交叉反应

换一种不同的封闭液;不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭,牛奶含生物素

操作设备被污染

保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁,无外源污染物

2 WB结果信号弱或无信号

原因

方案

蛋白未转到膜上

可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流

一抗、二抗等不匹配

选择针对一抗来源的种属抗体

过度封闭

使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶的抗体稀释液;试用不同的封闭液;减少封闭时间

洗膜过度

洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.05%的弱去垢剂Tween-20

曝光时间太短

延长胶片的曝光时间,超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时

3 杂带较多/特异性条带异常

原因

方案

细胞传代次数过多,蛋白表达模式分化

使用原始或传代少的细胞株或进行平行实验

样本处理过程中目的蛋白发生降解

使用新鲜制备的标本并使用蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作

一抗不纯

使用单克隆或亲和纯化的抗体,减少非特异条带

一抗特异性不高

重新选择或制备高特异性的抗体

技术支持

QC中心