免疫沉淀原理及操作方法

2017-12-15 13:25:42

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免疫沉淀原理:

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)是一种纯化蛋白质的方法。将目的蛋白的抗体与样品提取液孵育,使抗体和蛋白质在溶液中结合。然后用protein A/G 耦合的琼脂糖凝胶,从样品中将抗体/抗原复合物提取出来。这种物理方法可将所需蛋白质从样品中分离。然后样品可以通过SDS-PAGE 进行分离并做 Western blot 分析。


免疫沉淀流程:


IP实验步骤:

1.  收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30 min, 12 000g离心30 min后取上清;

2.  取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1 μg 相应的抗体和10~50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

3.  免疫沉淀反应后,在4°C 以3 000 g 速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1 ml 裂解缓冲液洗3~4次;最后加入15 μl 的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟;

4.  SDS-PAGE,Western blotting或进行质谱分析。


免疫沉淀实验成功关键点:

免疫沉淀实验的操作步骤比较多,同时由于在非变性条件下进行实验,所以要得到一个完美的实验结果,不仅需要高质量的抗体,同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验主要从蛋白样品处理,抗体-agarose beads孵育,抗体-agarose beads复合物洗涤和鉴定几个关键步骤控制操作。


一、 样品处理:

免疫沉淀实验成功与否,第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量,浓度以及抗原是否处于天然构象状态。

在这个环节中,除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外,最为关键的是裂解液的成份。常用的RIPA裂解液,主要含有pH7.4左右的离子缓冲液,接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等。


二、 抗体-agarose beads孵育

裂解细胞,使用制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜,也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug 抗体,最高可以添加至5 ug 抗体,过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。同时,为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。同时,Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同,结合一抗的种属和Ig亚型,选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物,这样可以达到最佳实验效果,而且省去了许多选择的烦恼。


三、 抗体-agarose beads复合物洗涤:

除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。

一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方,但去除甘油,以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。


四、 鉴定

免疫沉淀实验用途非常广泛,而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀,染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀),因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。

通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时,重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。


避免重/轻链的干扰,通常有二种解决办法:

1.  选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB检测,这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB检测,就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。

2.  使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联,然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物,最后离心去除抗体-agarose beads复合物,上清中只留下目的蛋白。

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