GST融合蛋白纯化实验步骤

2017-11-29 13:40:37

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在蛋白研究中,想获得可溶性蛋白,我们会优先考虑GST融合蛋白表达系统。

谷胱甘肽巯基转移酶(GST)是体内生物转化最重要的相代谢酶之一,是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒系统。GST是一个含有211个氨基酸的蛋白,通常将该蛋白加入到重组蛋白的末端以便对该重组蛋白进行纯化或检测。具有组氨酸的非融合蛋白会产生非特异性结合,这会阻碍组氨酸标签的亲和纯化。但GST标签则与之不同,由于GST对于其底物-谷胱甘肽具有极高的特异性,所以可以获得更高的纯度。

优点:增加外源蛋白的可溶性适用范围广可用不同的蛋白酶方便去除高特异性,纯化方便且温和提高外源蛋白的稳定性保留了蛋白的抗原性和生物活性

缺点分子量较大,可能会影响蛋白的功能和下游实验,纯化后需要去标签如果蛋白表达为包涵体,无法直接用GST标签纯化,可变复性后再进行纯化。

 

GST融合蛋白纯化实验中需要的几种Buffer

Lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10% Glycerol;

Equilibration/Wash buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0;

Elution buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 15 mM Reduced Glutathione

Regeneration buffer #1: 500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% SDS;

Regeneration buffer #2: 500 mM NaCl, 100 mM NaOAc pH 4.5, 0.1% SDS.

注意:可直接称取Reduced Glutathione粉末溶解在Equilibration/Wash buffer中,但是溶解后加NaOH将pH调至8.0。

 

GST融合蛋白纯化实验步骤

1. 依据表达测试蛋白表达量选择合适体积的Glutathione Agarose (载量: 50 mg/ml),用10 CV纯水将储存液中的酒精洗净,再用10 CV Equilibration buffer平衡;

2. 将平衡好的Glutathione Agarose加入已过滤的细胞裂解液中,4℃(或室温)孵育至少1小时;

3. 孵育后将裂解液加入亲和层析柱中,收集flow through,也可选择700g,离心2 min,缓慢倒出上清液;

4. 10 CV Wash buffer清洗杂蛋白,最后一滴用Bradford检测,如果Bradford变蓝则应该适当增加Wash体积,直到Bradford检测不变蓝;

5. Elution buffer将目标蛋白洗脱,用EP管分管收集,直到Bradford检测不变蓝;

6. 洗脱完成之后用5 CV Elution bufferGlutathione Agarose,再用10 CV纯水洗,最后加20%酒精,保存在4℃冰箱。

 

GST融合蛋白纯化实验常见问题及解决方案

问题一:目的蛋白与磁珠不结合或结合效率低

可能原因

解决方案

GST 融合蛋白被机械裂解的方法变性

 在裂解过程中,用温和的机械/化学裂解条件,裂解的条件必须依照经验来决定

标签蛋白改变了GST 的构象

检测所使用的pGEX 载体中GST的结合,可以通过降低结合的温度到4°C限制洗涤来改善结果。

GST 融合蛋白在样品中有聚集,导致沉淀

 

 在细胞裂解前加入DTT,在缓冲液中也加入DTT 

 

结合条件不佳

低于pH6.5或高于pH8时,融合蛋白与磁珠结合不充分导致结合效率低,确认磁珠在用于目的蛋白纯化前经过pH6.5~8.0缓冲液充分的平衡。

GST融合蛋白的浓度过低

 浓缩样品

目的蛋白与磁珠不结合或结合效率低

测序确认,调整阅读框以获得GST.Tag融合表达蛋白;使用蛋白酶缺陷型大肠杆菌作为表达宿主菌;如果有稀有密码子应采用Rosetta系列宿主菌。

问题二:目的蛋白不能洗脱或洗脱效率低

可能原因

解决方案

洗脱缓冲液的体积太少

增加洗脱缓冲液的体积

洗脱的时间不够

增加洗脱缓冲液与磁珠反应的时间

洗脱缓冲液中谷胱甘肽浓度太低

增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度

洗脱缓冲液的pH过低

增加洗脱缓冲液的pH值

洗脱缓冲液的离子强度过低

在洗脱缓冲液中加入0.1~0.2M的氯化钠

洗脱缓冲液中的谷胱甘肽被氧化

使用新鲜配制的洗脱缓冲液

问题三:洗脱的蛋白中有杂质

可能原因

解决方案

GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

加入蛋白酶抑制剂,可在裂解溶液中加入1mM PMSF

在宿主细菌中的蛋白降解

使用蛋白酶缺陷型菌株(比如lon-或ompT)

细胞破碎时超声处理过度

降低裂解时间,机械裂解前加入溶菌酶

问题四:目的蛋白酶切后电泳检测发现多条条带

可能原因

解决方案

蛋白酶切发生在宿主细菌内

检测条带何时出现:如果确定多余的条带在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在,这些条带可能是在宿主细菌中被降解的结果。目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa 的切割位点,请检查序列。

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