枯草芽孢杆菌蛋白表达的操作步骤

2017-10-16 13:53:58

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  枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。

枯草芽孢杆菌蛋白表达的具体操作步骤:

1、 针对外源基因片段进行密码子优化,基因合成目的片段(根据需求添加合适的纯化标签)。

2、 将目的基因片段连接到穿梭表达载体上,转化大肠杆菌。

3、 摇菌,准备合适浓度的质粒。

4、 制作枯草芽孢杆菌感受态细胞,将质粒转入不同的枯草芽孢杆菌宿主中,涂平板,37℃培养过夜。

5、 挑单克隆并进行筛选鉴定

6、 针对不同的表达载体,采用不同的蛋白表达方式进行表达,获得目的蛋白。如转化pHT43表达载体,获得阳性克隆后,37℃培养至OD600=0.8-1.0,添加0.1mM IPTG诱导剂进行不同时间温度条件的诱导表达,取样分析做表达测试。

7、 蛋白纯化测试,选择最优表达条件进行200ml表达纯化测试,估算蛋白得率。

8、 放大及纯化,依据最佳条件表达纯化目标蛋白。

9、 交付蛋白。

枯草芽孢杆菌蛋白表达操作流

枯草芽孢杆菌蛋白表达操作流程图

 

枯草芽孢杆菌表达系统常见问题:

1、用液体LB培养的枯草芽孢杆菌,为什么都有块状沉淀一样的东西,感觉是菌体粘在一起了,是正常现象吗?

枯草芽孢杆菌在发酵后期会产生类似物质,跟浓度无关。芽孢杆菌室温静置久了,会在培养基表面产生一层菌膜。

 

2、 枯草芽孢杆菌的转化,常用的转化方法包括电击方法、原生质体和化学方法,哪种转化效率高?

通常情况下电转的效率要比其他效率高,但是也要考虑其他因素。野生型枯草芽孢杆菌由于自身有很强的修饰系统,比较难转化。

 

3、把平板上培养的枯草芽孢杆菌接种到液体培养基中(50ml锥形瓶,封口),并在摇床中培养。但是摇床中有别的菌,枯草芽孢杆菌是否会污染到别的菌?

操作严格,封口良好的话,不会污染别的菌。夏季室温较高,适合细菌繁殖,较容易发生芽孢杆菌的交叉污染,需注意无菌实验操作规范。

 

4、 转化菌在抗性板上长出了单菌落,PCR验证质粒转化成功,接着摇瓶培养发现只在无抗培养基中长,有抗的没长,可能的原因?

可能原因:(1)可能质粒不稳定;(2)抗生素倒的板不均匀;(3)PCR的结果是假阳性。

 

5、 怎样分析处理枯草芽孢杆菌表达情况?

针对胞内表达,直接超声破碎获得上清和沉淀进行分析;针对胞外分泌表达,可以采用TCA的方法4度沉淀过夜浓缩,或带有相关标签树脂进行快速纯化分析培养基中的蛋白,同时分析胞内蛋白。

 

6、普健生物有哪些配套的表达菌株及载体?

适用于胞内表达的菌株168,1012及AS1,相关表达载体有pHT01和pHT254;

适用于胞外表达的菌株WB800N,相关表达载体pHT43。

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