细胞转染让你很忧桑?快来看看

2017-09-18 13:51:25

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  细胞转染是将外源分子如DNA,RNA导入真核细胞的技术。它已成为一种研究基因表达调控,基因突变分析,蛋白质生产的常规方法,其应用范围越来越广。

 

细胞转染可分为瞬时转染和稳定转染两大类:

  瞬时转染,外源基因进入受体细胞后,存在于游离载体上,不整合在细胞的染色体上。此时,外源DNA仍然以附加的形式存在于细胞内,因此,mRNA或蛋白质产物必须在短时间(1-3天)内进行测定或分析,而且质粒的人工构想和拷贝数可能会导致特异性调控元件失活或具有特异功能。其优点是快捷、简单,易于对结果进行分析,因此成为启动子功能分析的首选方法。

  稳定转染,外源DNA整合到宿主细胞的染色体上。由于外源基因被整合到细胞的染色体中,使得调控区能更精确的模拟正常功能,对随后的转录分析没有时间限制。缺点是需要进行药物筛选和细胞扩增,因此操作难度大,需要的周期较长。

 

转染的常见方法有:

(一)物理介导法电击法显微注射法、基因枪

(二)化学介导法DEAE-葡聚糖法磷酸钙法脂质体法

(三)病毒介导法:腺病毒法、逆转录病毒法

现在对于很多普通细胞系,常用的是瞬时转染方法中的脂质体法。

 

下面介绍下细胞转染的具体步骤:

1.转染前准备:转染前一天,取生长状况良好的细胞,经胰酶消化成单个细胞后,计数。根据实验需要,铺合适细胞量在板中,使第二天转染时的细胞密度达到80-90%。

2、细胞转染

(1) 在做转染实验前一般给细胞更换新鲜的完全培养基,并置于培养箱中继续培养。最好是加入加血清但不含抗生素的培养基。

(2) 准备几个无菌的1.5ml EP管,并做好标记。一支EP管上标记DNA(即质粒的名字),一支EP管上标记lipofectamine 2000。

(3) 分别在两支EP管加入50微升的opti-MEM。

(4) 在标记质粒的EP管里加入质粒,另一支EP管里加入脂质体。

(5) 分别轻轻混匀,室温静置5 min。

(6) 再将含有质粒的opti-MEM培养基加入到含有脂质体的opti-MEM的培养基中。

(7) 轻柔颠倒混匀,室温静置20 min。

(8) 将此质粒脂质体复合物直接加入24孔板中,轻轻推匀,置于培养箱中继续培养24 h-48 h。

理想的细胞转染转染效率高,不影响细胞正常生理活动;细胞毒性低;可重复性高;操作安全、简单;经济。

 

影响转染效率的主要因素主要有以下几种:

(1) 细胞状态:细胞处于对数生长期,细胞活力高,相应的转染效率好。反之,老化死亡的细胞转染效率则低。

(2) 细胞密度:转染效率对细胞密度很敏感。不同细胞类型有不同的最适细胞密度,一般贴壁细胞密度在70-90%、悬浮细胞密度在2-4*106/ml时效果最好。

(3) 转染试剂:不同转染试剂转染效率差别很大。例如,脂质体的转染效率尤其大于磷酸钙的。

(4) 转染方法:不同的转染试剂有不同的转染方法,因质粒的质量和操作手法的差异,不同实验室都有不同的转染条件。

(5) 血清:血清会影响脂质体-DNA复合物的形成,因此只需在脂质体与DNA的复合物形成过程中不含血清即可。

(6) 抗生素:阳离子脂质体增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞,降低细胞活性,导致转染效率降低。

(7) 细胞系:不同细胞系转染效率可能相差很大。如293T的转染效率则远远高于NIH3T3。

  对于一个特定的实验而言,通常细胞系已经固定,能够优化的只有根据经济能力选择合适的转染试剂,控制好细胞的状态和铺板时的密度以及转染实验时尽量去除血清和抗生素的影响。

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