质粒抽提—实验室必备技能之一?

2017-09-04 16:13:39

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  质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中,是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。采用强碱液、加热或溶菌酶(主要针对革兰氏阳性细菌)可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和 TritonX-100(一般很少使用)可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后, 细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,简称cccDNA)的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。

  质粒抽提最常用的方法是碱裂解法,它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。当然,碱裂解法也有缺陷:容易导致不可逆的变性。要降低不可逆的变性,就要控制好碱裂解的时间。

碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液:

溶液

50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0),10 mmol/L EDTA(pH 8.0),在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min,4℃保存。

溶液Ⅱ 

 0.2 mmol/L NaOH(从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释),10 g/L SDS(室温保存)。

溶液

5 mol/L乙酸钾 60.0 mL,冰乙酸 11.5 mL,无菌水28.5 mL, 4℃保存,使用时置于冰浴中。  

下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作:

1)柱平衡:向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer,12000 rpm离心30-60 s,倒掉收集管中的废液;

注意:吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜,提高质粒的得率;吸附柱平衡后应立即使用,长时间放置会影响其吸附效果。

2)收菌:将过夜培养的菌液用8000 g,2-3 min低温离心,吸弃液体培养基;

注意:高拷贝的质粒,需要5-15 mL的培养菌液;低拷贝的质粒,则需要15-30 mL的培养菌液;残留的液体培养基过多会影响细菌的裂解效果,应尽可能吸干培养基。

3)向离心管中加入250 μl 溶液Ⅰ(加入RNase A),吹匀菌沉淀并将悬液转移至新1.5 mL EP管中;

注意:菌体悬浮不完全会导致裂解不完全,质粒提取量和纯度会降低。

4)EP管中加入250 μl 溶液Ⅱ(裂解Buffer),温和翻转EP管6-10次,使菌体充分裂解,液体变得澄清浓稠(开盖拉丝);

注意:所用时间不宜超过5 min,以免质粒被破坏;切勿剧烈震荡;液体未变得澄清,则表明裂解不充分,可适当减少菌体量或增大Buffer使用量;若溶液Ⅱ出现浑浊,可37 ℃水浴几分钟,待液体恢复澄清即可使用。

5)EP管中加入350 μl 溶液Ⅲ,温和翻转EP管6-10次,此时可观察到管内出现白色絮状沉淀,12000 rpm室温离心10 min;

注意:若上清中仍有少量白色絮状物,可再次离心2-3 min直至液体澄清。

6)将离心后上清转移至吸附柱中,12000 rpm离心30-60 s,倒掉收集管中的废液;

7)可选:向吸附柱中加入500 μl Buffer PD(富含蛋白酶),12000 rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液;

注意:此步对富含内源核酸酶的宿主菌(endA+)是必须的,对于endA-宿主菌可省略。

8)向吸附柱中加入600 μl Wash Buffer(加入无水乙醇),12000 rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液;

9)重复步骤8一次;

10)将吸附柱和收集管放回离心机中,12000 rpm空转离心2 min;

注意:此步骤非常关键,乙醇是否去除干净会影响后续的洗脱效率以及PCR等效果。

11)将吸附柱转移至新的1.5 mL EP管中,拿到超净工作台中开盖鼓风吹5-10 min;

12)向吸附柱膜的中央滴加40-50 μl预热Elution Buffer或者DD水,关盖静置3-5 min,12000 rpm离心2 min;

注意:洗脱Buffer预热后效果更好;可以根据质粒的拷贝数、宿主菌等因素调整洗脱Buffer的添加量。

13)离心后将EP管内的液体重新滴加至吸附柱膜上,12000 rpm离心1 min;

14)做好标记,取2 μl质粒跑1%琼脂糖凝胶电泳检测验证;

15)提取出的质粒-20保存。

 

抽提质粒的常见问题

1、提不出质粒或者质粒提取量很少

(1) 菌体中无质粒:有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如柯斯质粒在大肠杆菌中保存不稳定,因此不要频繁转接,每次接种时应接种单菌落。另外,检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

(2) 质粒拷贝数低:由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低,可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

(3) 菌种老化:若是甘油保藏菌,需要在活化后再培养摇菌;建议涂布平板培养后,重新挑选新菌落进行液体培养。

(4) 吸附柱过载:不同产品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的质粒量很大,请分多次提取。若用富集培养基,例如TB或者2×YT,菌液体积必须减少;若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率,则需调整LB培养液体积。

(5) 碱裂解不充分:使用过多的菌体培养液,会导致菌体裂解不充分,可减少菌体用量或增加溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的用量。对低拷贝数质粒提取时,可加倍使用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,有助于增加质粒提取量和质粒质量。

(6) 溶液使用不当:溶液Ⅱ和Ⅲ在温度较低时可能出现浑浊,应置于37 ℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液,才能使用。

(7) 洗脱液加入位置不正确:洗脱液应加在硅胶膜中心部位,以确保洗脱液会完全覆盖硅胶。膜的表面,达到最大洗脱效率。

(8) 洗脱液不合适DNA只在低盐溶液中才能被洗脱,pH洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH 7.0-8.5之间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内,如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。

(9) 洗脱体积太小:洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高,但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

(10) 洗脱时间过短:洗脱时间对回收率也会有一定的影响。洗脱时放置1 min可达到较好的效果。

(11) 乙醇残留:漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂,再加入洗脱缓冲液。

(12) 质粒未全部溶解:洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。

 

2 质粒纯度不高

(1) 混有蛋白质:不要过多使用菌体。溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ处理并离心后,溶液应为澄清的,如果还混有微小蛋白质悬浮物,可再次离心去除后再进行下一步骤。

(2) 混有RNARNase A处理不彻底,请减少菌体用量或加入溶液Ⅲ后室温放置一段时间。如果溶液Ⅰ已保存6个月以上,要及时向Ⅰ中添加RNase A。

(3) 混有基因组DNA:加入溶液Ⅱ、Ⅲ后应温和混匀,若剧烈震荡,可能把基因组DNA剪切成碎片混在质粒中。如果加入溶液Ⅱ后过于黏稠,无法温和混匀,请减少菌体用量。细菌培养不要超过16 h,时间过长会导致细胞和DNA的降解。

(4)溶液Ⅲ加入时间过长:溶液Ⅲ加入后,放置时间不要太长,否则有可能产生小片段DNA污染。

(5) 宿主菌含大量核酸酶:宿主菌含大量核酸酶,在质粒提取中降解质粒DNA,影响提取质粒DNA的完整性,最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌,例如DH5α和TOP10。

(6) 裂解时间过长:加入溶液Ⅱ后裂解时间不宜超过5 min。

(7) 质粒的二聚体和多聚体形式:是质粒复制过程中形成的,与宿主菌相关,电泳可检测出。

 

3质粒浓度的检测

  DNA纯度的判断大多根据OD260/OD280的比值检测,符合要求、纯度高的DNA样品其OD260/OD280在1.8-2.0之间,低于此范围表明蛋白质含量超标,高于此范围表明样品中含有RNA。

  DNA的纯度也可以根据OD260/OD230的比值判断,OD230主要评估样品中是否存在一些有机污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等。纯度较高的DNA样品OD260/OD230的比值在2.0-2.5之间,比值小于2.0则表示存在有机物的污染,比如乙醇或者酚类残留。如果遇到此种情况,可以再沉淀一次,然后重复乙醇洗涤的过程。

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