抗体人源化的关键步骤是?

2017-08-24 09:51:53

202 admin

  自单克隆抗体问世以来,最常用的鼠源性单克隆抗体在临床诊断及治疗等方面发挥了巨大的作用,但常用的鼠源单克隆抗体具有较强的免疫原性,在临床应用中会引起人抗鼠抗体(HAMA)反应, 导致抗体半衰期缩短(不到20 h),治疗效果减弱。利用DNA重组和蛋白质工程技术,对抗体基因进行重组,可在保留鼠源抗体对抗原有效结合部位的同时最大限度地降低非结合部位的鼠源性,这种通过重组基因表达的既有鼠源成分又有人源成分的抗体称为人源化抗体,又可称为基因工程抗体。抗体人源化则成为了将鼠源性单抗转化为安全有效的治疗药物的重要方式。

人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体、表面重塑抗体和全人源化抗体等几类。

一、嵌合抗体  

  由于90%的HAMA是针对抗体C区的,设计从分泌鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞基因组中分离功能性Ig V区基因,然后与人C区基因按一定方式拼接,克隆到表达载体中并转入宿主细胞所制备的抗体称为嵌合抗体(Chimeric Antibody)。这种抗体的Fab区是鼠源的, Fc区是人源的。由于整个抗体分子约2/3 部分为人源的,较好地避免了HAMA反应,延长了抗体在体内的半衰期,改善了抗体药物动力学。

  1984年美国科学家Morrison等首次将人Ig的C区基因与鼠单克隆抗体的V区基因连接,成功表达人-鼠嵌合抗体以来,基因工程抗体的研究发展迅速。已有多种不同特异性的基因工程抗体经FDA批准进入临床使用,显示了良好的应用前景。

 

二、改型抗体

  改型抗体也称CDR植入抗体(CDR grafting antibody),抗体可变区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域,直接决定抗体的特异性。将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区,替代人源抗体CDR,使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性,同时减少其异源性。然而,抗原虽然主要和抗体的CDR接触,但FR区也常参与作用,影响CDR的空间构型。因此换成人源FR区后,这种鼠源CDR和人源FR相嵌的V区,可能会改变单抗原有的CDR构型,导致结合抗原的能力下降甚至明显下降。虽然目前已能对抗体进行分子设计,在人源FR区引入鼠源FR区的某些关键残基(如配置得当,其亲和力可与原有小鼠抗体的亲和力相当),但人源化抗体常达不到原有鼠源单抗的亲和力。

 

三、表面重塑抗体

  表面重塑抗体是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域,在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换;另外,所替换的区段不应过多,对于影响侧链大小、电荷、疏水性,或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区(CDR)构象的残基尽量不替换。

 

四、全人源化抗体

  全人源化抗体是指通过转基因或转染色体技术,将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中,使动物表达人类抗体,达到抗体全人源化的目的。

  当前正处于临床研究的多种抗体中,嵌合抗体和人源化抗体所占比例大于70%。目前的人源化抗体,主要用于肿瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病的治疗以及抗移植排斥反应和抗病毒感染等方面。通过完善蛋白表达纯化平台,稳定细胞系构建平台和噬菌体展示技术平台,结合经验丰富的专家团队(曾经成功研制并且上市过治疗性抗体药物),普健生物可为您提供个性化方案定制,一对一项目跟进,细致化实验报告一站式服务,服务内容包括:

1)抗体可变区/抗体全长测序

通过鼠源单克隆抗体细胞系进行抗体可变区/抗体全长基因序列测序,2-4周。

2)嵌合抗体表达及抗原抗体结合分析

结合可变区序列及人源恒定区序列设计嵌合抗体,通过哺乳系统进行嵌合抗体表达;对嵌合抗体进行抗原抗体结合分析,同时可提供样本给客户进行亲和力检测及生物活性检测,8~10周。

3)人源化抗体设计

基于CDR移植、回复突变、生物信息学分析等方法对VH和VL区域进行人源化设计,根据需求提供不同套餐供客户选择,2-3周。

  我们知道抗体人源化改造的关键问题就在于确定抗体FR区上对抗体亲和力产生重大影响的人源化替换位点,换句话说就是定位影响CDR区构象的关键氨基酸。这决定了人源化抗体项目的成败。因此,必须高度重视人源化抗体的设计。否则,很可能“一失足成千古恨再回头资金已打水漂"。也只有做好人源化抗体设计,后续的步骤才有意义。

4)人源化抗体表达

密码子优化,基因合成,亚克隆,转染,抗体表达及纯化,8-10周。

5)人源化抗体性质检测

结合力检测:ELISA/FACS测定EC50值,或Biacore/Octet测定Kd值;人源化抗体体外生物活性分析并与嵌合抗体进行比较;人源化抗体与同源性物种的交叉反应性分析;人源化抗体生物物理特性分析:SEC-HPLC分析,DS-PAGE分析,DSC分析。

普健生物人源化抗体的筛选基于以下评估准则:

· 哺乳细胞蛋白表达系统(HEK293F或CHO)进行瞬时表达的表达水平。

· 基于检测指标EC50(通过ELISA或FACS检测)或Kd(通过Biacore或Octet检测),将人源化抗体结合力与嵌合抗体结合力进行对比。

· 基于体外生物活性测试,将人源化抗体活性与嵌合抗体活性进行对比。

· 基于体外结合试验,检测人源化抗体与相关同源物种的交叉反应性。

· 基于生物物理性质分析,将人源化抗体与嵌合抗体进行对比,主要为以下几点:

      a)通过SEC-HPLC鉴定大分子聚集程度。

      b)还原性及非还原性SDS-PAGE鉴定。

      c)通过DSC分析检测Tm值。

更重要的是,普健生物抗体人源化方案制定是个性化的,收费方式是分步的!最后,相信随着分子生物学技术的发展,尤其是鼠抗体人源化技术,抗体库技术、转基因技术的迅速发展,以及对疾病机理的不断深入研究,人源化抗体在临床应用中将会更加广泛让我们拭目以待。

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