内毒素-细菌弥留之际的秘密武器

2017-08-08 16:52:31

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一、内毒素简介

内毒素,是革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌、伤寒杆菌、结核杆菌和痢疾杆菌等)细胞壁中的一种成分,只有当细菌死亡溶解或被人工破坏后才释放出来。内毒素覆盖于细胞壁的黏肽上,成分为脂多糖(LipopolysaccharidesLPS),又称之为“热原”。广义上说,微量能引起恒温动物体温异常上升的物质,统称为热源,包括外因性热源(细菌性热源、化学热源)和内因性热源。狭义的热源即内毒素。脂多糖对宿主是有毒的,其毒性成分主要为类脂质A。各种细菌内毒素的毒性作用大致相同,可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。内毒素注射到机体内虽可产生一定量抗体,但这种抗体抵消内毒素毒性的作用很微弱。

内毒素结构示意图

二、内毒素和外毒素的区别

内毒素不是蛋白质,因此非常耐热:在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏,只有在160℃的温度下加热2到4个小时,或用强碱、强酸、强氧化剂加热煮沸30分钟才能破坏它的生物活性。与外毒素不同之处在于:内毒素不能被稀甲醛溶液脱去毒性成为类毒素。

区别

外毒素

内毒素

产生菌

多数革兰氏阳性菌,少数革兰氏阴性菌

多数革兰氏阴性菌,少数革兰氏阳性菌(如苏云金芽孢杆菌)

存在部位

多数活菌分泌,少数菌裂解后释出

细胞壁组分,菌裂解后释出

化学成分

蛋白质

脂多糖

毒性作用

强,对组织细胞有选择性毒害效应,引起特殊临床表现

较弱,各种类的毒性效应相似,引起发热、白细胞增多、微循环障碍、休克等

免疫原性

强,刺激宿主产生抗毒素

较弱,甲醛液处理后不形成类毒素

稳定性

60℃半小时被破坏

160℃ 2-4小时被破坏

处理方式

特定抗生素治疗为主

消炎药物、抗氧化剂治疗为主

三、内毒素测定方法

1)家兔热源检测法

1923年Seibert提出了用家兔检测热源的方法;1942年,美国药典首先将家兔热源检查项收入药典成为法定方法;1953年,中国药典开始收载该方法,随后的世界各国药典都以动物热源检测法作为药品质量监测的方法之一。这种化验程序是探测内毒素的高热活性(发热诱导)。在实验兔子的直肠插有温度计,且兔子感染了含内毒素的实验溶液。三小时后兔子的直肠检验出发热的迹象。该法检测到内毒素的最小浓度为0.1 ng/ml。但热源检测法存在一定的局限性:重现性差;对药物引起的增加、抑制作用无法控制;不同细菌产生的热源质的致热域有差别;非定量反应。

2)(音hòu)实验法

鲎是一种古老的栖身于沿海的生物,属节肢动物门,形似蟹,在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一带,有“活化石”和“ 海底鸳鸯”之美称。鲎的血液中含有铜离子,因此它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提取物就是

鲎试剂

鲎试剂能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应,反应速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关,是体外检测内毒素的敏感试剂。

鲎检测凝胶法反应原理

现在可使用更灵敏的光度测定法,其基于鲎变形细胞溶胞产物(LAL)和合成的产生颜色的底物。光度测定法又包括显色基质法和浊度法。

l 显色基质法

该方法通过检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少来测定内毒素含量。根据检测原理,分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在着量化关系来测定内毒素含量。动态显色法是检测反应混合物的色度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或是检测色度增长的速度。

l 浊度法

该方法通过检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化来测定内毒素含量。根据检测原理,可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反映混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度和透光率)之间存在着量化关系来测定内毒素含量。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或是检测浊度增加的速度。  

 

四、内毒素的去除

如果检测的样品中证实有内毒素,那么选择合适的方法除掉它就显得更为重要。但内毒素成分(多糖、蛋白、脂质等)复杂,热稳定性和化学稳定性极强,常规方法很难除去。为了保证生物医学试验的成功率和可靠性以及生物医药制品的安全性和有效性,彻底地去除样品和溶液中的内毒素成为了科学家们必须克服的难题。

内毒素对生物制品的危害虽然很严重,但只要我们了解了内毒素的特性,就可以采取有效的方法加以控制和去除。细菌内毒素的去除可采用亲合层析法、离子交换层析法、疏水层析法、分子筛层析法、超滤法、吸附法和试剂盒等。

1亲和层析法

亲和层析法是利用被分离的生命大分子物质和特异性配体之间能可逆结合与解离的原理而建立的,其特点是上样量大,纯化过程简单迅速且分离效率高,被分离物质的活性不易丧失。特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子。但每分离一种物质都必须找到合适的配体,并将其制备成固相载体,在洗脱中,交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中,从而造成不良影响,如抗体、染料等配基,成本相对昂贵。

2)离子交换层析

离子交换层析(Ion Exchange Chromatography,简称为IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小有差别进行分离。内毒素在pH>2时带负电荷,与阴离子交换介质Q或DEAE基团有较强结合,可在目标物流穿或洗脱后,用高盐缓冲液或NaOH去除,这是离子交换法去除内毒素的基础。

3疏水层析法

疏水层析原理如下:蛋白质表面一般有疏水基团与亲水基团,疏水基团可与疏水性载体在高盐浓度时结合。在洗脱时,将盐浓度逐渐降低,因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化,可用于分离用其他方法不易纯化的蛋白质。内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性,在高盐下会凝集,无法挂上疏水层析柱。可选择能结合目标蛋白的疏水介质而去除内毒素。

4)分子筛层析法

分子筛是利用凝胶的网状结构,根据分子大小进行分离的一种方法。一般重组产品分子量为几万道尔顿,而内毒素分子量为几十万至上百万道尔顿,常是多聚体,因此利用分子筛可以有效去除内毒素,但其处理量小,处理时间较长。

5超滤法

如果原液及保护剂的分子量与内毒素分子量差别较大,那么选用适当的超滤膜,通过超滤来去除内毒素是可能的,但由于膜吸附过程中产热及系统残留等原因,活性损失较大。

6)吸附法

热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性质稳定、吸附性强,且兼具助滤和脱色作用,故广泛用于注射剂生产,但应注意吸附药液所造成的主药的损失。

7试剂盒法

内毒素的去除都会使用商业化的试剂盒。一般利用多粘菌素B(polymixin B )连接到琼脂糖微球上,进行特异性去除内毒素。多粘菌素B可通过静电作用、离子作用、亲水作用和分子之间的相互作用等多种因素吸附内毒素,从而达到内毒素去除的目的。

 

五、注意事项

在内毒素去除过程中,切记使用不含内毒素的塑料制品和玻璃器皿。为了避免在初始内毒素去除后对质粒DNA的再污染,建议仅使用经认证无热原或无内毒素的新塑料制品。内毒素强烈粘附于玻璃器皿,并且在洗涤期间难以完全除去。标准实验室高压灭菌方法对内毒素水平几乎没有影响,但180°C过夜加热玻璃器皿可破坏任何附加的内毒素分子。重要的是不要通过使用含内毒素的试剂纯化无内毒素DNA,所有缓冲液都需要无内毒素。

 

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