WB实验天天做,问题总是层出不穷?

2017-07-21 12:48:55

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  WB,全称Western Blot,中文一般称为蛋白质印迹。WB是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色,通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白在所分析的细胞或组织中的表达情况。

  蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克George Stark)。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot。

 

 

Western Blot 实验发明者——乔治·斯塔克George Stark)

  Western Blot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜NC膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

  Western Blot 这个名称的由来很有意思,最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家,但印迹的对象是DNA链,他把这种技术称为Southern Blot,后来类似地出现了两个过程相似但对象不同的印迹方法,一个是基因组一个就是蛋白质印迹,人们就把名字定为Northern和Western,这已经与这两个技术的发明人没有关系了。

Western Blot分为四个基本的步骤:


样品制备

电泳

印迹

免疫检测

 

AtaGenix对Western Blot的四个步骤中常见的问题进行了归类:

一、样品制备

1)如果目标蛋白是膜蛋白或胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多。目前市面上有专门针对亚细胞组分的蛋白抽提试剂盒,可以高效地富集到活性蛋白。

2)组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性。

 

二、电泳

1)条带呈笑脸状(︶):凝胶不均匀冷却,中间冷却不好。

2)条带呈皱眉状(︵):迁移过快,电泳系统温度偏高。

3)拖尾:可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者凝胶两边聚合不完全。

4)纹理(纵向条纹):样品溶解不好,样品中含有不溶性颗粒,电泳前将样品离心去除颗粒。

5)条带偏斜:电极不平衡或者加样位置偏斜。

6)条带两边扩散:加样量过多。

 

三、电泳转移

1)大分子量蛋白的转移效率低?

· 优化转移缓冲液

转移缓冲液中加入20%甲醇,甲醇可以降低蛋白的洗脱效率,增加蛋白和膜的结合能力;

转移缓冲液中加入终浓度0.1% SDS。

· 提高转移电压/电流。

· 增加转移时间。

· 选择优质的转移膜。

2)膜、滤纸、胶大小有何讲究?

滤纸的长宽分别比胶小1-2 mm,而膜的长宽分别比胶大1-2 mm。

绝对禁忌:上下两层滤纸因为过大而相互接触,这样会导致短路。

四、免疫检测

1)Western blot结果中背景高且不均匀?

· 抗体浓度太高:一抗或二抗浓度太高会导致高背景,可增加抗体稀释倍数。

· 一抗孵育的温度偏高:建议4℃结合过夜。

· 使用的封闭液不兼容:对比不同的封闭缓冲液。

· 非特异性位点封闭不足:优化封闭缓冲液,最好的封闭缓冲液具有系统依赖性。

· 提高封闭液中蛋白的浓度;优化封闭时间和/或温度,室温封闭至少1 h或者4°C封闭过夜。

· 在封闭液中加入Tween-20(终浓度为0.05%)。

· 封闭液中与其他蛋白发生抗体的交叉反应:换一种不同的封闭液;不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭,牛奶含生物素。

交叉反应的检测:封闭一张干净的膜,与抗体一起孵育,然后用超感应化学发光底物检测。

· 洗膜不充分:降低HRP结合物的浓度;增加洗涤次数和洗膜缓冲液的体积。

· 如果洗涤液中无Tween-20,添加Tween-20使其终浓度为0.05%。

· 膜在实验过程中干过:实验过程中要注意保持膜的湿润。

· 选择的膜容易产生高背景:一般硝酸纤维素膜(NC)的背景会比PVDF膜低。

· 膜的曝光时间过久:缩短印迹膜曝光到胶片的时间;在孵育过程中始终进行震荡。

· 膜被污染:小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合;不能空手持膜,始终戴干净手套或用镊子。

· 缓冲液污染或结块沉淀:制备新的缓冲液。

· HRP处产生聚集体:用0.2 μm过滤器过滤结合物。

· 结合可产生斑点:用一种新的高质量的结合物。

· 缓冲液中有污染:缓冲液使用前过滤或使用新的缓冲液。

· 操作设备被污染:保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁,无外源污染物。

· 保证在转膜后没有凝胶留在膜上(蛋白可能黏在胶上导致背景)。

 

2)Western blot结果中信号弱或无信号?

· 蛋白未转到膜上:

转膜结束后,用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率(总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原);

确保转膜过程中胶与膜完全接触;

确保转印夹层排布正确;

确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜;

确保转印部件在电印迹过程中未过热;

使用正对照和/或分子量Marker;

可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流。

· 蛋白未完全结合到膜上:在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜,需使用小孔径的膜进行。

· 一抗、二抗等不匹配:订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物;通过设置内参可验证二级检测系统的有效性。

· 一抗或/和二抗浓度低:增加抗体浓度;延长抗体孵育时间;抗体与靶蛋白的亲和力可能很小;抗体可能失活,可用斑点印迹检测其活性。

· 一抗或/和二抗浓度太高:使用太多一抗或二抗可能导致底物迅速耗竭,呈现出很弱的信号,应至少成倍稀释一抗/二抗(可4-10倍)。

· 一抗失效:使用有效期内的抗体,分装保存,避免反复冻融取用,工作液现用现配。

· 过度封闭:使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶的抗体稀释液;试用不同的封闭液;减少封闭时间。

· 洗膜过度:洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.05%的弱去垢剂Tween-20。

· 缓冲液中含有叠氮钠:叠氮钠是一种HRP的抑制剂,缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂。

· 曝光时间太短:延长胶片的曝光时间,超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时。

· 底物孵育时间太短:在使用超感应底物时需进行5分钟的底物孵育。

· 酶或底物失活:超感应化学发光底物和超感应west膜室温状态下化学底物可保存至少12个月,超感应免疫膜化学发光底物可保存至少6个月。

*为衡量底物的活性,准备一个小量的工作液在一个暗室内,加入少量的HRP结合物,会观察到绿光。如果未检测到光,底物或HRP结合物均有可能失活。

确保两底物无交叉污染,两种底物试剂的污染可能导致活性下降。

· 膜可以修复剥离,重新用探针检测,在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性:优化剥离程序;如有必要可重新用探针检测;避免在同一张膜上重复进行探针检测。

· 抗原在膜上消解:封闭底物(如明胶)可能含有蛋白水解酶活性。

· 印迹膜保存时蛋白降解:准备一张新的印迹膜。

 

3)Western blot结果中杂带较多或特异性条带位置不对?

· 细胞传代次数过多,使其蛋白表达模式分化:使用原始或传代少的细胞株或进行平行实验。

· 体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式:乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等,本身可以呈现多条带:查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小。

· 目的蛋白有其他剪切本:查阅文献或生物信息学分析可能性。

· 样本处理过程中目的蛋白发生降解:使用新鲜制备的标本并使用蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作。

· 上样量过高,太敏感:适当减少上样量。

· 一抗不纯:使用单克隆或亲和纯化的抗体,减少非特异条带。

· 一抗或者二抗浓度偏高:降低抗体浓度,增加二抗对照;选择特异性更强,只针对重链的二抗。

· 一抗特异性不高:重新选择或制备高特异性的抗体。

· 蛋白存在二聚体或多聚体:SDS-PAGE电泳上样前,煮沸10 min,以增强蛋白质解聚变性。

 

4)其他现象

· 膜上多处出现黑点或黑斑:可能是由于转膜时有气泡或抗体分布不均,抗体与封闭剂结合,应尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动,过滤封闭剂。

· 反白(条带显白色):可能是由于HRP结合物浓度过高,应至少成倍(可4~10倍)稀释一抗/二抗。

· 靶蛋白分子量偏低或偏高:可能是由于SDS-PAGE胶浓度选择不合适,应调整胶浓度,分子量大的蛋白用低浓度胶,分子量小的蛋白用高浓度胶。

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