你养的细胞,可能又被支原体污染了?

2017-07-14 11:29:37

557 admin

  支原体(Mycoplasma)又称霉形体,广泛分布于自然界(有80余种),为目前发现的最小最简单的细胞,也是唯一一种没有细胞壁的原核细胞。支原体基因组为一环状双链DNA,分子量小,基因数量为480个,直径50-300 nm,能通过细菌滤器,大小介于细菌和病毒之间。菌落小(直径0.1-1.0 mm),在固体培养基表面呈特有的“油煎蛋”状。不能维持固定的形态而呈现多形性,对渗透压敏感,对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感。革兰氏染色不易着色,故常用Giemsa染色法将其染成淡紫色。



支原体模型

支原体污染
  支原体是细胞培养中最常见的,干扰实验结果的一种污染。但由于不易被察觉,有些污染的细胞仍在继续使用。据查,目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11%受到支原体污染。因此,对支原体污染应严加防范。支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染(一些支原体在人体是正常菌群)、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。组织细胞培养工作中,主要从以下几个方面来预防支原体的污染:控制环境污染;严格实验操作;细胞培养基和器材要保证无菌;在细胞培养基中加入适量的抗生素。


支原体检测方法
(1)分离培养法
  分离培养法是支原体检测的金标方法,其检测精确度最高。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样,并接种到最适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体,它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长,最终形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果,因此被誉为支原体检测金标准。不过分离培养法也存在两个弊端,一是检测时间太长,支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。二是它尽管可以检测绝大多数支原体种类,分离培养法也有力所不及的时候,有的菌种也无法培养,固体培养基上可能有假菌落。
  如果你实在不想等这么久,或者希望在分离培养法的等待过程中先拿到初步结果,你可以试一试DNA、PCR或酶学检测方法。不过需要注意的是,上述检测方法都不能单独检出所有类型的支原体,而且灵敏度也没有分离培养法高,所以最好结合使用两种方法以获得最可靠的检测结果。
  如果实在不想等这么久,或者希望在分离培养法的等待过程中先拿到初步结果,可以试一试酶学检测法、ELISA法、DNA染色法或PCR法。不过需要注意的是,上述检测方法都不能单独检出所有类型的支原体,而且灵敏度也没有分离培养法高,所以最好结合使用两种方法以获得最可靠的检测结果。
酶学检测法
  酶学检测是将可疑样本添加到特定底物中,在这一体系内支原体的酶可以将ADP转化为ATP,随后能利用ATP发光的luciferase酶就可以指示支原体的存在。
ELISA检测法
  ELISA也能用于支原体检测,以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体,来检测培养物中是否含有支原体。
DNA荧光染色法
  需要将可疑样品与指示细胞共同培养,因此一般需要几天时间。DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞,如果原样本中含有支原体,那么当细胞DNA被荧光染料(如Hoechst染料)染色时,就可以在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒。分离培养法用来检测支原体M. hyorhinis菌株并不可靠,而DNA法可以准确的将其检测出来。
  国际支原体组织(IOM)推荐培养法和DNA荧光染色法作为常规检测方法,最近PCR法的发展令人鼓舞。
PCR检测法
  PCR法检测支原体只需几个小时,是最快也是最灵敏的支原体检测方法。该方法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本,其中PCR引物通常针对支原体的16S rRNA基因。在凝胶电泳过程中,支原体DNA会显示为特异性条带,以此指示支原体的存在。PCR法可以检测大多数支原体,但谨慎起见最好同时使用另一种检测方法来进行验证。
  普健生物生产的支原体PCR检测试剂盒(Mycoplasma PCR Test Kit)是一款具有快速、灵敏、特异性高等特点的支原体检测试剂盒,可用于细胞、培养基、动物血清等的支原体检测。本产品通过聚合酶链式反应技术(PCR)特异扩增支原体16s-rRNA 基因保守区域片段,进行支原体检测,能够检测包括M. arthritidis, M. hominis,M. hyorhinis,M. fermentans,M. orale,M. salivarium,M. bovis,M. bovigenitalium,M.pneumoniae,M. pirum等在内的数十种支原体。

产品组成
 产品组分详见下表:


产品保存
-15 ~ -25℃保存,自检定合格之日起有效期为12个月。

 

使用说明
1.收取待检样品:
贴壁细胞:待细胞生长至80%左右即可,使用细胞刮刀刮取细胞(送检细胞不能用消化液消化细胞)。
悬浮细胞:待细胞生长至80%左右即可直接进入下一步离心。
注:一般以6孔板接种细胞,当细胞生长至80-90%时即可取样进行检测。培养液中的青霉素和链霉素不会影响检测效果。
2.1000 rpm离心5 min,留100-200 ul培养基重悬细胞,沸水浴10 min;
3.将煮沸的细胞悬浮液12000 rpm离心3-5 min;
4.所得样品取4ul直接用于PCR检测,或冻存于-20℃备用;
充分融化PCR反应液,按照下表配制PCR反应体系:

 

 

将所有PCR反应管放入PCR仪,按照以下参数运行PCR反应程序:

 

 

5. 取5 ul PCR产物(无需再加溴酚蓝),进行1%琼脂糖凝胶电泳:110V电泳20-30 min,根据电泳仪情况,适当调整电泳参数。


支原体阳性细胞扩增片段在270 bp左右


电泳参考图
(M:marker,+:阳性,-:阴性,1-3:检测为阳性的细胞,4-5:检测为阴性的细胞)

注意事项
1.使用本试剂盒前请仔细阅读本说明书全文。
2.为保证结果可靠性,建议每次实验都有阳性和阴性对照,每个反应各加4。μl,阳性对照随试剂盒提供,阴性对照为灭菌ddH2O,需客户自己准备。
3.操作时应尽量少说话,或带口罩,因口腔中也含有支原体,可能引起样品污染,而造成假阳性。
4.细胞培养物中含有青霉素和链霉素等抗生物素不会影响检测结果,如果用户需要进一步提高检测灵敏度,建议用不含双抗的培养基培养细胞2-3天后进行检测。
5.本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。
6.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

技术支持

QC中心