震撼来袭:AtaGenix自主研发TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Fluorescein-12)

2017-06-15 23:08:35

671 admin

  细胞凋亡(Apoptosis)一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下,通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(Programmed Cell Death)。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生(Morphogenesis)、组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化和肿瘤的发生进展起着重要作用,并具有潜在的治疗意义。细胞凋亡途径中各事件的发生是有时序性的,即各事件按先后顺序依次发生,最终导致凋亡小体的出现,细胞随后发生凋亡。典型特征为:细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)的外翻;线粒体膜电位的丧失;细胞核凝缩和断裂。在细胞凋亡的中晚期,核酸内切酶(某些Caspase 的底物)的活化是关键的过程,在核小体之间剪切核DNA,导致核DNA 被裂解成180-200 bp寡核苷酸大小的片段。因此,这个过程被用于检测凋亡,在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的“DNA 梯形带”。但是,这种方法既不能检测单个细胞水平的凋亡,又不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态等方面的信息。这一切可以由脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling,经典的TUNEL法)来完成:细胞凋亡晚期,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将荧光素/酶标记的dUTP结合到DNA3-末端,从而可进行凋亡细胞的检测。

  TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3-OH形成,很少能够被染色。TUNEL可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

AtaGenix 经过不断的尝试与努力,自主研发的TUNEL法检测细胞凋亡试剂盒就要上市了!

试剂盒优点

(1)灵敏度高:背景染色极低,阳性染色强,可以在单细胞水平检测到细胞凋亡,同时由于凋亡早期就有 DNA断裂,可以检测到早期的细胞凋亡。

(2)特异性好:TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞,而不容易标记坏死细胞,也不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同),既可以把凋亡和坏死区分开,也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。

注:极少数细胞凋亡时没有DNA断裂,此时不适用TUNEL法检测。在别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下,最好同时检测多个凋亡指标。

(3) 快速方便:只需将固定好的细胞或组织经染色及洗涤后,即可置于荧光显微镜或者流式细胞仪下进行凋亡检测,整个实验操作仅需1-2小时即可完成

(4)应用范围广:可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况,也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。

5灵活:适于固定的细胞和组织,可以使样品收集、储存和运输成为可能。

6质优:每一批产品都经过严格的检查

产品组分详见下表:

组分

ABC001(20T)

ABC001(50T)

ABC001(100T)

10x Equilibration Buffer

1.5 ml

1.5 ml x2

1.5 ml x4

Fluorescein -12-dUTP Nucleotide Mix

100 μl

250 μl

500 μl

Recombinant TdT Enzyme

20 μl

50 μl

100 μl

Proteinase K

20 μl

50 μl

100 μl

保存方式:-15 ~ -25℃保存, Fluorescein-12-dUTP  Nucleotide  MIX避光保存于-20ºC

使用说明

1.样品预处理

1.1 细胞样品

细胞爬片或者细胞涂片经PBS洗涤后,4%多聚甲醛室温固定30分钟,PBS洗涤,再经终浓度为0.02 μg/μlProteinase K溶液通透5-10分钟;PBS洗涤3次,每次5分钟。

注意细胞涂片要做好防脱处理。

1.2 组织切片

1.2.1 石蜡切片


1)室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中脱蜡10-20分钟。换用新鲜的二甲苯,再脱蜡10-20分钟。

2)室温下用梯度乙醇(100%100%95%80%70%)各浸泡5分钟。

3PBS浸泡润洗切片,滴加终浓度为0.02 μg/μlProteinase K溶液通透15-20分钟。

4PBS洗涤3次,每次5分钟。

注意这一步必须把蛋白酶K洗涤干净,否则会严重干扰后续的标记反应。

1.2.2 冰冻切片


1)将玻片短暂回温后浸没在4%多聚甲醛溶液 (溶于PBS)中,室温孵育30分钟。

2PBS浸泡润洗切片,滴加终浓度为0.02 ug/ulProteinase K溶液通透10-15分钟。

3PBS洗涤3次,每次5分钟。

注意Proteinase K帮助组织和细胞进行染色剂的通透,孵育时间过长会导致组织或细胞从切片上脱落,过短则造成通透性处理不充分,影响标记效率,为了得到最好的结果,可能需要优化通透时间。

2. 阳性样本和阴性样本的处理

(1)根据实验要求设置阳性对照组和阴性对照组,按比例用去离子水稀释DNase I Buffer,配置1xDNase I Buffer溶液,阳性对照组滴加终浓度为10 U/mlDNase I缓冲液,实验组和阴性对照组滴加1xDNase I Buffer使其完全覆盖,湿盒孵育10 min

(2)去掉多余的液体,并将载玻片用去离子水彻底洗3-4次。

3. 染色标记

参考下表配置一定量的TUNEL检测液

试剂组分

实验组

阳性对照组

阴性对照组

1x Equilibration Buffer

44 μl

44 μl

44 μl

Fluorescein -12-dUTP Nucleotide Mix

5 μl

5 μl

5 μl

Recombinant TdT Enzyme

1 μl

1 μl

-

ddH2O

-

-

1 μl

注意:TUNEL检测液必须一次性使用完毕,避免冻存。

1)用去离子水按1:10稀释10x反应平衡液配置成1x反应平衡液。

2)按照表格比例配置TUNEL检测液,每组切片滴加适量的TUNEL检测液使其完全覆盖(针对涂片、切片或者96孔板、48孔板、24孔板及12孔板,一般50 μl TUNEL检测液可足够用于大小约为2.5*2.5cm的样本),室温湿盒避光孵育60分钟。

3)将切片置于PBSHBSS溶液中室温浸洗2次,每次5分钟。

4)吸干切片上多余的水分,避免干片,滴加0.05 μg/μlDAPI溶液,室温湿盒避光孵育10分钟。

5)将切片置于PBS溶液室温浸洗3次,每次5分钟。

6)用抗荧光猝灭封片剂封片。

4. 观察检测

荧光显微镜下观察,激发波长范围450-500 nm,发射波长范围515-565 nm

5. 流式细胞术检测悬浮细胞

1)将3-5×10 6个细胞用PBS2次,每次4℃1500 rpm,离心10分钟。然后0.5 ml PBS重悬。

2)固定细胞:加入1 ml 4%配制于PBS中的多聚甲醛溶液,冰上放置30分钟。

34℃1500 rpm,离心5分钟,去上清并且重悬于1 ml PBS。重复洗一次并用0.5 ml PBS重悬细胞。

4)通透细胞:细胞可用配制于PBS中的0.1% Triton ® X-100溶液通透,室温放置5分钟,或者用0.1 μg/μlProteinase k溶液,室温放置5分钟。

51500 rpm,离心5分钟,弃上清,细胞重悬于1 ml PBS

6)转移细胞至一个1.5 ml的微量离心管。

71500 rpm离心5分钟,去上清并把沉淀重悬在80 μl 1x Equilibration Buffer (1:10的比例用去离子水稀释10x Equilibration Buffer)中。室温孵育30分钟。

8)细胞在1500 rpm离心10分钟,去上清并把沉淀重悬在50 μl TdT孵育缓冲液中。37℃避光孵育60分钟。

9直接加入DAPI染液,使其终浓度为0.05 μg/ml,避光室温孵育10分钟。

10)用流式细胞仪分析细胞。测量495-520 nmFluorescein -12-dUTP的绿色荧光和364-454 nmDAPI的蓝色荧光。

注意DAPI将凋亡和未凋亡的细胞都染成蓝色。只有凋亡的细胞核中有FITC-12-dUTP掺入而产生的绿色荧光。

常见问题解答

1) 荧光高背景

Ø 高速分裂或增殖的细胞,有时也会出现细胞核DNA断裂;

Ø TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液稀释TdT2-5倍后再操作。稀释后的TdT酶需当日使用完毕;

Ø 支原体污染。利用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染;

Ø FITC被非特异性掺入整个操作过程需保证样品的湿润

2) 荧光信号弱

Ø A Triton X-100通透或者蛋白酶K作用不充分,可调整通透剂的浓度和孵育时间;

Ø 荧光淬灭,荧光剂需避光保存和使用;

Ø 由于凋亡细胞贴壁性减弱,因此在操作过程中应轻柔操作避免细胞丢失;

3)出现非特异性标记

Ø 有些细胞和组织里的DNA酶活性比较高,易导致非特异性标记。解决办法是取完细胞或组织后立即对其进行充分固定,阻止酶活;

Ø 操作过程中可能混入DNA酶的污染

注意事项

1.试剂准备阶段

实验需自备阳性对照相关DNase I Buffer及DNase I;用于洗涤细胞的PBSHBSS;用于封片的抗荧光淬灭封片液;用于固定的4%多聚甲醛免疫染色固定液及用于通透的含0.3% Triton X-100的免疫染色强力通透液。

2. 样品准备阶段

悬浮细胞:可以按照细胞悬液的TUNEL检测方式操作,上流式细胞仪检测结果,需要起始细胞量不低于3–5×106个细胞。

贴壁细胞:制作细胞爬片,用作爬片的玻片最好用多聚赖氨酸处理,防止脱片。

细胞涂片:制备密度为5×107 cells/ml的细胞悬液,取100 μl涂片。用来制作涂片的玻片最用多聚赖氨酸处理

建议细胞样品以细胞爬片或涂片的方式进行检测。

3. 一定要设置对照

l 阳性对照

切片对照可使用DNaseⅠ部分降解的标本。细胞对照可使用地塞米松(1 um)处理3-4 h 的大、小鼠胸腺细胞和人外周血淋巴细胞。

意义:可判断实验方法和操作有无问题。

l 阴性对照

不加TdT酶,其余步骤与实验组相同。

意义排除凋亡外的非特异性染色

4.温馨提示

本产品仅限于专业人员的科学研究使用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。 为了您的安全,请穿实验服并戴一次性手套操作



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