SDS-PAGE二十二问,献给身处实验室的你

2017-06-09 11:22:07

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PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),聚丙烯酰胺凝胶电泳,是以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的一种常用电泳技术,本文就PAGE展开了关于实验过程中常见的问题及应对措施的讨论。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化。 催化聚合的常用方法有化学聚合法和光聚合法,化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。PAGE有Native-PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)和 SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶)两种形式。Native-PAGE过程中蛋白质能保持完整状态,并依据分子量大小、形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。原因如下:SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二三级结构。而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS 胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比有较高的分辨率。先把较稀的样品加在浓缩胶(作用是堆积,凝胶浓度较小,孔径较大)上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸时,电泳开始后,HCl解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快, 甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成一稳定的界面,蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。


浓缩胶示意图


分离胶示意图

SDS-PAGE的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液,而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加,并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “甲叉双丙烯酰胺-丙烯酰胺” 比率的增加而变小,比率接近 1:20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺-丙烯酰胺”为1:29 配制,试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。用5-15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表(双丙烯酰胺-丙烯酰胺摩尔比为1:29):


SDS-PAGE经常应用于蛋白提纯过程中纯度的检测。纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带,但如果蛋白质是由不同的亚基组成的,它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS-PAGE具有较高的灵敏度,一般只需要不到微克量级的蛋白质,而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况,这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。但在做SDS-PAGE实验过程中,有可能问题层出不穷。AtaGenix总结了一些实验过程中常见的问题及应对措施,希望能够帮助到大家。


1.SDS-PAGE中各主要成分的作用是什么?

聚丙烯酰胺:丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关。

制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.8,分离胶选择pH8.8,选择Tris-HCl系统。

TEMED与AP:AP 催化单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合成聚丙烯酰胺。TEMED是催凝剂,可加速AP催化作用。

SDS:阴离子去污剂,它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物, SDS带有大量负电荷,当其与蛋白质结合时,所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷,因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异,使蛋白质均带有相同密度的负电荷,可利用分子量的差异将各种蛋白质分开。

甘氨酸:它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高, 有利于甘氨酸的离子化,所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后,沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后,SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶,并被筛分而依各自的大小得到分离。

上样缓冲液:蛋白上样缓冲液(loading buffer)是一种以溴酚蓝为染料,5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖,这样可以增加样品的比重。上样缓冲液中的甘油非常重要,起增加粘度的作用,这可以阻止样品从梳样孔中扩散到电泳缓冲液。


2.样品如何处理?

根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:

1)还原SDS处理

在上样buffer中加入SDS和DTT(或β-巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中只根据分子量来分离。

注:一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5 min,再离心加样。

(2)带有烷基化作用的还原SDS处理

碘乙酸胺的烷基化作用可以很好并经久牢固地保护SH基团,得到较窄的谱带。另外碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象。

3)非还原SDS处理

生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1% SDS沸水中煮3 min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。


3.两块玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?

1)玻璃没有洗干净。

2)过硫酸铵和TEMED的用量不合适,用量相对较多,凝胶凝固过快胶就会不平。

3)加完试剂以后没有很好地摇匀,导致有些部位的聚合剂浓度过高,聚合相对较快造成胶不平。

4)灌胶后没有立刻用水或者异丙醇压胶面:边缘胶是不容易聚合完全的,灌完胶后要立即加异丙醇覆盖。浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶。另外还可以在压顶试剂如异丙醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度。

5)温度也是影响胶聚合的重要因素,如果为了让胶更快地凝固而把胶放到50度的温箱,由于受热不均匀,也会造成胶聚合不均匀。


4.怎样防止胶漏?

1)每次电泳完后,洗净玻璃、胶条和其他附件。

2)避免玻璃边缘破损很重要,尤其是下面和胶条接触的地方。

3)找一块很平的桌面,使两块玻璃底面非常齐。

4)胶条一定要干,跑完电泳后,胶条可放在实验台上晾着。

5)下面的胶条注意不要老化,如果有裂纹的话可用保鲜膜垫在上面,或者反过来用。

6)玻璃在使用过程中容易造成小的缺口,从而导致封条无法完全密封。装好架子后,可在玻璃底边抹上一层薄薄的凡士林(两边多点,容易从两边漏)。转移到电泳槽的时候去掉封条,把底上的凡士林擦干(注意一定要擦干净,尤其是少量进入了两块玻璃之间空腔的,因为凡士林不导电,会影响电泳的效果)。

(7)可以在海绵垫下再垫一些纸,使它与玻璃贴的更紧密,或者在玻璃底部用琼脂糖封上。

(8)先把两块玻片放在夹子上,使底部对齐,再夹紧两块玻片,然后取下再在其下面垫上垫片。


5.分离胶加上后为什么要立即加水?

(1)一是为了使分离胶界面保持水平(用水就可以把它压平),使蛋白质分子跑时在同一水平线上。

(2)二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。


6.怎么处理“ 微笑”(两边翘起中间凹下)条带的形成?

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致(多出现于较厚的凝胶中),可待其充分凝固再做后续实验。


7.怎么处理“皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因?

常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的,当凝胶和玻璃板组成的"三明治"底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象。可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。


8.出现拖尾现象应该怎么办?

主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。可在加样前离心、选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂、重新配制时间过长的电泳缓冲液或者降低凝胶浓度。


9.出现纹理(纵向条带)现象应该怎么办?

主要是不溶性样品颗粒引起的,可在加样前离心或加适量样品促溶剂。


10.蛋白带偏斜怎么办?

常常是由于滤纸条或电极放置不平行或加样位置偏斜而引起,检查位置是否正确并作出相应调整。


11.蛋白带过宽,与邻近蛋白泳道的蛋白带相连?

这是由于加样量太多或加样孔泄漏引起的,可减少加样量。


12.蛋白带模糊不清和分辨不佳?

(1)聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。

建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。

(2)为了提高分辨率,不要加过多的样品,小体积样品可跑出窄带。

(3)加样后应立即电泳,以防止扩散。

(4)选择合适的凝胶浓度,使组分得以充分的分离。

(5)样品的蛋白水解作用(系统中的内源性蛋白酶会水解样品蛋白)也引起扩散而使分辨率降低,在缓冲液中加蛋白酶抑制剂可减少这种情况的发生。


13.什么是“鬼带”,如何处理?

在跑构象复杂的蛋白质分子时,“鬼带”常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀。主要是还原剂在加热过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。但它却与目标条带有相同的免疫学活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。可在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta-巯基乙醇,以补充不足的还原剂或加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。


14.为什么溴酚蓝不能起到指示作用?

我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象,这主要与缓冲液和分离胶的浓度有关,可更换正确pH值的缓冲液或降低分离胶的浓度。


15.为什么电泳的条带很粗?

电泳中条带很粗是常见的事,主要是蛋白未浓缩好的原因。可适当增加浓缩胶的长度,保证浓缩胶贮液的pH正确(pH6.7)或适当降低电压。


16.为什么电泳电压很高而电流却很低呢?

这种现象一般初学者容易遇到。比如电压50 v以上,可电流却在5 mA以下。这主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路所致。包括:a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。将电泳槽正确装配即可。


17.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗?

一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致,后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧导致空气进入引起的。


18.蛋白带型聚团是什么引起的?

(1)上样过量:降低蛋白上样量或降低蛋白浓度。

(2)样品粘度过大:延长煮沸时间。

(3)样品中含有不溶物质:离心或过滤样品以除去特定污染物。

(4)制胶不佳:确保制胶均匀,一次完成。


19.凝胶时间不对,或慢或快,怎么回事?

通常胶在30 min-1 h内凝固。如果凝的太慢,可能是TEMED和APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用。TEMED不稳定,易被氧化成黄色,以此可以鉴定TEMED的质量。如果无法获得无色透明的TEMED,只能适当增加用量以保证聚胶速度。如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶。


20.电泳时间比正常要长?

可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的PH选择错误,即缓冲系统的PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。


21.蛋白Marker条带缺失或条带模糊怎么办?

(1)分离胶浓度不正确:配置浓度正确的分离胶。

(2)缓冲液放置时间过长:定期更换缓冲液。

(3)甲叉丙烯酰胺贮存液放置时间过长或配置不准确:及时更新贮存液,此贮存液配制时在37℃水浴溶解30 min以上。

(4)电泳时间过长:观察前面的指示剂染料,掌握恰当的电泳时间。


22.条带跑得比正常的窄?

(1)可能因为胶凝得不均匀,聚合得不是很好:灌胶的时候尽量混匀。

(2)可能与拔梳子有关:拔梳应该迅速。

(3)冲洗加样孔时要小心,以免把上样带扭曲。

(4)胶配好了用枪吹几下再灌胶。

(5)等指示剂跑到两层胶交界成一线时,再调高电压。

(6)可能是样品的问题:如果盐浓度较高,便会挤压其它条带,致使条带宽窄不一。

(7)常见的原因是每孔上样量不均匀:应确保每孔中上样量一致。

(8)有可能是电极缓冲液,也有可能是凝胶缓冲液:更新缓冲液。














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