玩转酵母,重组蛋白不用愁

2016-12-23 16:06:53

1005 admin

相信将来据此开发和改良出的独特酵母表达平台必能在众多系统中脱颖而出,贡献出更多优质蛋白,将您的实验烦恼一扫而光。

  酵母菌,实际上是一些单细胞真菌的统称,在自然界中分布广泛。其中有很多种属已被成功用于外源基因的表达和研究。它不仅集合了原核表达系统培养方便、经济实用、易于大规模发酵等优点,而且还具备真核表达系统蛋白翻译后修饰的功能。今天AtaGenix这位老司机将带你熟悉我们拥有的酿酒酵母赤酵母两套蛋白表达系统,让你在重组蛋白的道路上越走越远。

 

 

1.酿酒酵母
  酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),在传统工艺中是面包师和酿酒师们的魔法棒,在现代技术中则变身为科学家们的实力宠儿。它是酵母中最早用于基因克隆和表达的宿主,于1996年其全基因组测序工作完成,遗传背景清晰。该表达系统主要有两种类型的载体,包括整合型载体和附加型载体。
  整合型载体不含酵母DNA复制起始区,不能在酵母细胞内自主复制。表达载体转到酵母细胞后借助其上的整合区元件与宿主染色体发生同源重组,随染色体复制而进行复制和表达。稳定性高,只是拷贝数低下。像AtaGenix拥有的pATX3载体则将整合区设定在酿酒酵母核糖体DNA(rDNA)基因簇上,转化重组后可以得到多个整合拷贝,在数量上占有优势。
  附加型载体则是以其自身来源的2μ质粒作为出发质粒衍生出的多种表达载体。这类载体在酵母细胞内本身拥有独立自主复制的能力,常以30或更多拷贝数存在。AtaGenix的pYES2-NTA就是这种类型的表达载体,可使外源基因得到有效表达。
  通常酿酒酵母宿主菌是各式各样的营养缺陷型(如his3-,leu-,trp-,ura3-等)酵母,能适用于不同载体的转化筛选。但是在表达外源蛋白时,常会出现载体丢失、蛋白产物不均一、过度糖基化、不易积累以及副产物产生乙醇等问题。不过由于其遗传操作简单,可同时容纳不同的2μ质粒,酿酒酵母现在常用于真核基因转录调控的研究如酵母双杂交,蛋白相互作用等方面。通过模拟酵母染色体复制功能元件,能够构建大片段序列克隆系统——酵母人工染色体(YAC)。还有近年来发展起来的酵母表面展示等技术,使它在生命科学的舞台上又一次焕发出绚丽光彩。

 

2.毕赤酵母
  毕赤酵母(Pichia pastoris)是继酿酒酵母后,于上世纪80年代初开发出来的的第二代酵母表达系统。它属于一种甲醇营养型酵母菌,拥有的专属强有力AOX(醇氧化酶基因)启动子,可严格调控外源基因表达,进行高密度发酵。作为二代系列,它不但继承了初代成本低、周期短、能进行蛋白糖基化、磷酸化、酰脂化等翻译后加工修饰等优点,而且避免了表达载体不稳定、诱导不严谨等缺陷,能够表达出有生物活性的蛋白,是表达真核来源蛋白的理想菌株。
  但是在用二代酵母表达外源蛋白时,面临和出现的问题也较多:如何选择合适的表达载体,酵母转化不成功,无法鉴定到阳性克隆,蛋白不表达,表达过程中出现污染,表达量低等等。AtaGenix认为要解决以上问题可从以下几个方面进行考虑:
  首先,需要分析和优化所要表达的基因序列。当基因中AT含量高时有可能造成转录提前终止,因为AT丰富区可能存在转录提前终止信号,适当保持AT 含量在30%~55% 范围内是有必要的;基因的二级结构如发卡结构也是一个重要影响因素;同时毕赤酵母有密码子偏爱性。一套好的基因优化系统是从多个方面进行综合评估的。
  其次,选择胞内表达还是分泌表达是由外源蛋白自身理化特点决定的。毕赤酵母由于无内源性质粒,无论是胞内还是分泌表达,载体都属于整合型表达载体。外源蛋白的空间构象(二三级结构)、糖基化位点、水溶性、氨基酸组成、二硫键复杂程度以及其他的理化特点都会影响毕赤酵母对蛋白的分泌。蛋白过大或二硫键过多都不利于蛋白的分泌表达。而且目的基因中也不能含有毕赤酵母的Kex2酶降解位点(连续两个碱性氨基酸,如能够识别和水解lys-Arg-C端)。AtaGenix拥有各种胞内表达和胞外表达载体,可满足客户不同层次的需求。
  再次,良好的实验操作习惯、丰富的实验操作技巧、成熟的理论规范都是外源蛋白成功表达不可或缺的条件。虽然网络上有详细全面的有关毕赤酵母表达系统的资源,但AtaGenix拥有的丰富实战经验,如高效的毕赤酵母感受态细胞制备,简便的pcr阳性克隆验证方法,高通量的表达测试,严格的无菌操作规范等则是我们的客户能实实在在感受到的。
  最后,提高蛋白在酵母系统中的表达量有很多种方法。DNA-转录-翻译-翻译后加工整个表达环节都能影响外源蛋白的表达。分析外源蛋白性质、构建多拷贝质粒(基因串联表达、重复转化等)、选择不同种类的启动子(pAOX、pGAP 等)、采用不同信号肽(载体信号肽或自身信号肽)、增加产物稳定性(培养基中加PMSF,蛋白水解物等)、优化培养和诱导条件(诱导起始菌体浓度、诱导时间、不同剂量诱导剂等)都可以在不同程度上改变蛋白的表达量。这些因素在蛋白表达的不同时空环节主导地位是不同的,如初期可能是基因剂量(多拷贝)起决定作用;当蛋白表达水平提高到一定程度后,酵母细胞的分泌折叠能力会成为关键因素;到了后期,蛋白定性则成为主要限制因素。因此,获得蛋白的最佳表达条件需要各个环节各种条件的综合优化。
  其实,无论哪种表达系统,提高表达量和优化表达条件都遵循以上原则,而酵母表达系统由于其在真核界中的优势地位而被广泛应用。相信将来据此开发和改良出的独特酵母表达平台(如酵母糖基人源化途径改造)必能在众多系统中脱颖而出,贡献出更多优质蛋白,将您的实验烦恼一扫而光。

 

 

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