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022021-09

技术分享 | 分子筛纯化助你九月开卷有益

说到分子筛,大家肯定都不陌生。分子筛又叫做凝胶过滤层析柱,空间排阻色谱等。是应用蛋白质分子量或分子形状的差异去进行分离的一项蛋白纯化技术,目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用。

基本原理

当样品从层析柱的顶端向下运动时,因分子量和分子形状的差异,直径较小的蛋白质能进入凝胶颗粒,流程较长;而较大的则不能进入凝胶颗粒,流程较短从而被迅速洗脱。因此分子量越大,流速越快,流出时间就越短;分子量越小,流速越慢,流出时间越长。利用分子量不同的蛋白在凝胶中保留时间不同,最终达到分离分子大小不同的蛋白质的目的。

实验要点

凝胶介质的选择

常用的凝胶介质有:葡萄糖凝胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel P)等。凝胶介质的选择是在考虑到分辨率和稳定性因素的前提下,依据待分离的蛋白和杂蛋白的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。

如上表所示,选用合适孔径的凝胶很大程度取决于目标蛋白的分子量和杂蛋白的分子量。

选用Sephadex G-25和 G-50,可以将目的蛋白和小分子物质分开。

选用Sephadex G-10、G-15、Bio-Gel P-2或P-4,可以对小肽和低分子量物质的脱盐。如果是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离,一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。

层析柱的选择

层析柱分离效果与凝胶柱床的体积、柱长、柱的直径、柱比等相关。组别分离时,大多采用2~30cm长的层析柱,柱床体积为样品溶液体积的5倍以上,柱比一般在5~10之间;而分级分离一般需要100cm左右的层析柱,其直径在1-5cm范围内,小于1cm产生管壁效应,大于5cm则稀释现象严重。并要求柱床体积大于样品体积25倍以上,柱比在20~100之间。

凝胶介质的预处理

凝胶柱的制备凝胶型号选定后,将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀,溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀的费时较长,可采用加热的方法使溶胀加速,即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸,1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。

凝胶柱的填装

将层析柱与地面垂直固定在架子上,并且下端流出口用夹子夹紧。在装柱时关闭层析柱下口,在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液,然后沿着柱子一侧将缓冲液中的凝胶搅拌均匀,边搅拌边将凝胶连续性倾入,继续加入凝胶液,保持其持续沉降。待凝胶沉积约5厘米左右时,打开柱子下口,控制流速在1ml/min。

样品的处理与上样

加样和洗脱凝胶床经过平衡后,在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和,再用滴管加入样品。为了达到良好的分析效果,上样量必须保持在较小的体积,一般为柱床体积的1%~5%,蛋白质样品上样前应进行浓缩,使样品浓度不大于4%(样品浓度与分配系数无关),但分子量较大的物质,溶液的粘度将随浓度增加而增大,使分子运动受限,故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2,因此上样前,样品要经滤膜过滤或离心,除去可能堵塞色谱柱的杂质。

洗脱与收集

样品加入后打开流出口,使样品渗入凝胶床内,当样品液面恰与凝胶床表面相平时,再加入数毫升洗脱液中洗管壁,使其全部进入凝胶床后,将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连,预先设计好流速,然后分部收集洗脱液,并对每一馏份做定性、定量测定。在一定范围内,蛋白质流出的速度与分子量的对数呈线性关系,可以根据下面公式计算:

lgM=K1-K2 Ve(Ve是洗脱体积,即从加样到出峰时流出的体积,K1和K2是常数,随实验条件而定。测定分子量时,先用标准蛋白测定出一条标准曲线,再根据目的蛋白的洗脱体积计算分子量。)因为蛋白质能否进入凝胶与其分子形状有关,所以标准蛋白的分子形状应与待测蛋白相同。此方法一般用于测定球状蛋白的分子量。

分子筛使用小Tips

▲连接层析柱之前,检查系统管路、阀门已经排除气泡;确认顶端的接头锁

▲实验前,低流速平衡层析柱直至UV及pH信号稳定

▲缓冲液用单一缓冲液或含盐缓冲液作为洗脱液即可,洗脱过程中始终保持一定的操作压,流速不可过高,保持在0.5~3.0mL/min即可。

▲凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用,样品洗脱完毕后,凝胶柱既已再生,不必特殊处理,并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌,可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠与0.002%洗必泰等,也可用高压蒸汽0.1Mpa 30min灭菌。在下次层析前应将抑菌剂除去,以免干扰洗脱液的测定。

常见问题

■层析柱内填料干裂:检查层析柱每个连接处,重新拧紧;用脱气去离子水低流速冲洗层析柱直到恢复等等。测定柱效或重复之前做过的样品,如果柱效变化不大或者对于样品分离的效果影晌不大,则继续使用;否则,建议更换层析柱。

■层析柱进气:用大量脱气去离子水反向低流速冲洗层析柱,直到小气泡被带出。

■层析柱柱床胶面下降:长时间低流速反向冲洗层析柱,直到工作流速下胶面恢复adaptor消除顶端死体积,后测定柱效差异,决定是否更换。


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