普健生物(武汉)科技有限公司(AtaGenix)

112022-03

昆虫系统表达-大分子蛋白\跨膜蛋白表达福音

  IBEVS (Insect Baculovirus Expression Vector System),即昆虫杆状病毒表达系统,是高效的真核表达系统之一。杆状病毒属于杆状病毒科(Baculoviridae),分为核多角体病毒属和颗粒体病毒属,病毒粒子呈杆状,是一类专一性感染节肢动物并具有囊膜的DNA病毒。基因组 DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内,大小在 90-180kb之间。由于其不具有任何对哺乳动物有潜在致病性的动物病毒片段,昆虫杆状病毒表达系统问世以来,得到了人们的高度重视。此外,经细胞获得重组病毒后,还可在宿主昆虫幼虫、蛹体内进行表达,这是昆虫表达系统独有的优势。

  与大肠杆菌、酵母以及哺乳动物细胞表达系统相比,IBEVS 在以下四个方面具有特殊的研究价值:

  01、作为超高效的真核基因表达载体,生产有用的工程蛋白

  02、作为基因工程病毒杀虫剂,提高害虫防治效率

  03、研究杆状病毒基因组的结构与功能

  04、研究真核基因表达的调控机制


AcMNPV和Bac-to-Bac的由来

  苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedro-virus,AcMNPV)是杆状病毒表达系统最初使用也是目前应用最广泛的杆状病毒。AcMNPV的基因表达分为4个阶段:立早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。其中在极晚期基因表达过程中,有两种高效表达的蛋白--多角体蛋白和P10蛋白。多角体基因和P10基因的启动子具有较强的启动能力,且均为病毒复制的非必需成分,因此这两个基因位点成为了杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。

  1981年L.K.Miller基于AcMNPV的分子生物学性质和分子技术提出杆状病毒可作为载体表达外源基因的理论,两年后,G.E.Smith等成功利用AcMNPV作为载体在Sf细胞中表达了人β-干扰素基因,将这一理论改写成了现实。1990年-1993年,P.A.Kitts进一步通过线性化技术,将该载体的重组效率提高了上百倍。

  获得重组病毒的方式主要有两种:同源重组和转座。其中转座方式的代表有Bac-to-Bac表达系统。它是1993年由美国孟山都(MONSANTO)公司成功研发的技术,利用细菌转座子原理,在大肠杆菌内就完成重组病毒的构建,这一开发革命性地改变了昆虫杆状病毒的构建方法。


杆状病毒表达系统的优化历程

  杆状病毒表达系统的应用并不是一开始就顺利且高效,经过了科学家对其启动子、糖基化修饰等方面的不断改进,如今才得以成为一种有力的科学工具服务于生命科学及医学领域。

  基因敲除:

  01、敲除病毒本身影响外源基因表达的chitinase(几丁质酶基因)和 v-cathepsin (组织蛋白酶基因),从而有助于提高分泌型重组蛋白的表达

  02、敲除病毒基因组上的p26, p10 以及p74基因有效提高了重组蛋白表达水平,但没有提高感染细胞的活力


  糖基化改造:

  把昆虫细胞中缺少的糖基化酶克隆到Bacmid上,使蛋白的糖基化更接近哺乳动物细胞。


  启动子、Kozak序列和UTR的优化:

  P10或polyhedrin启动子已经是强启动子,但通过对上下游相关序列的改造依旧进一步极大地提高外源基因的产量


  抗凋亡Bacmid:

  将靶向昆虫凋亡效应蛋白Caspase的小RNA序列克隆到Bacmid上,使病毒感染的昆虫细胞抗凋亡,从而提高外源基因的表达量


宿主细胞选择

  杆状病毒表达系统中的宿主细胞多用草贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9、Sf12以及商品化的High FiveTM(Trichoplusia ni,Tn-5B1-4)


Bac-to-Bac的优势

  01、由于重组病毒的分离是通过蓝白斑筛选,不存在野生型和非重组型病毒污染的问题,因此不需要传统繁琐的空斑分析来纯化重组病毒。

  02、很大程度上缩短了重组病毒构建所需要的时间且重组效率达到100%。

  03、外源基因在昆虫细胞内能进行正确折叠,表达出的目的蛋白结构上更接近天然蛋白,且具有完整的生物学功能。

  04、昆虫细胞能对翻译后蛋白进行磷酸化、糖基化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等加工修饰。

  05、杆状病毒能容纳大分子的插入片段,能包装大的基因片段。

  06、杆状病毒表达系统具备在同一细胞内同时表达多个基因的能力,既可采用不同的重组病毒同时感染细胞,也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因,表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。

  07、昆虫细胞悬浮生长,容易放大培养,有利于大规模表达重组蛋白。

  08、杆状病毒对脊椎动物无感染性,现有研究也表明其启动子在动物细胞中没有活性,因此在表达癌基因或有潜在毒性的蛋白时明显优于其他系统。


普健生物的杆状病毒表达系统

  1、表达载体

  普健生物的杆状病毒表达系统采用pFastBac1载体为供体质粒,组装具有Tn7L和Tn7R的左右两臂序列,两臂序列之间是多角体蛋白的PH启动子,然后是多克隆酶切位点和SV40的Poly A位点。且pFastBac1供体质粒含有庆大霉素抗性基因便于筛选。

  普健生物(AtaGenix)亦有双表达载体pFastBac Dual来丰富您的选择。其特点是在单个载体上有两个启动子,可以使用 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统同时在昆虫细胞中表达两个蛋白。该载体具有两个强启动子,多角体蛋白启动子和 p10启动子,可实现目的蛋白的高水平表达。

  2、表达细胞器

  普健生物(AtaGenix)实验室依据多年探索经验对sf9 (图1为融合GFP标签的目的蛋白在sf9细胞中的表达情况实拍)和High Five细胞株进行了驯化,使其适合在无血清培养基中悬浮培养,且表达量大大提高。相对于胞内表达的细胞自身本底蛋白而言,分泌表达将大大减少它在纯化过程所带来的麻烦。