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内参蛋白,你选对了吗?

我们常说的WBWestern Blot),是一种利用特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或者生物组织样本染色,基于染色位置和其深度从而衡量某一蛋白质在样本细胞或者组织中表达情况的一种方法。是研究分子生物学、生物化学和免疫遗传学中的入门方法,是每个生物学人都需要掌握的起手式。

 

提到WBWestern Blot)不得不提到实验中的标注参照物,即内参。为什么需要内参呢,因为蛋白表达量存在差异,只有设定内参才能表达出这种差异。由于内参的这种特性,所以要求被选择的内参蛋白在各个组织细胞中表达相对恒定,这样就不会因为外部条件变化而引起表达量的波动。我们常选择管家基因表达的蛋白作为内参,其稳定的特性让它能很好的监控整个实验体系是否正常。这也是为啥实验结果出现异常,师兄师姐以及厂家技术支持第一个问题就会问我们是否设置内参,或者内参是否正常的原因。

 

WB过程中,可能存在总蛋白浓度测定有误,或者在上样过程中操作出现问题,针对表达量不高的蛋白,就更容易因为此类误差影响结果分析。所以需要我们设定内参进行校正,用每个样本目的含量/内参含量=每个样本目的蛋白的相对含量,再进行趋势比较。上述巴拉巴拉讲了一堆,肯定又有人要问了,上面每个中文字都认识,连起来就不知道是啥意思。小编总结内参作用到以下三句要义中,一定要牢记哦,不要等到reviewer退稿才来哭哦!

1校正蛋白样品定量以及上样过程中的误差,保证实验结果的准确性

2作为空白对照,检测WB过程中蛋白转膜是否完全以及发光显色体系是否正常

3内参校正方法:每个样本目的含量/内参含量=每个样本目的蛋白的相对含量

 

那么各位要问了,如何选择内参呢?

来,答应编编把下图点右键收藏

 

 

新人表示图看不懂?

没关系,听小编慢慢道来

我们常说的内参指标一般有β-actin、β-tubunlinGAPDHLamin B等,实际运用的时候面对这些指标我们该如何选择呢?其实内参的选择也是有规律可循的

 

1.针对样本种属来源

a.样本来源为哺乳动物细胞或者组织样本,常用β-actin、β-tubulinGAPDHLamin BHistone H3Na,Katpase

b.样本来源为植物的样本,大多选择plant actinRubisco

c.如果遇见不常见的样本来源如何选择内参呢,那么我们就只有根据现有文献选择内参,一般都是大错不错的

2.考虑目标蛋白分子量

目标蛋白分子量大小是选择内参抗体的另一关键因素,一般情况下要保证目标蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。如目标蛋白分子量在50KD左右哺乳动物细胞或者组织样本,那么我们就可以选择β-tubulin或者GAPDH

3.目的蛋白表达部位

蛋白检测中有一类表达部位比较特殊的蛋白---核蛋白,针对核蛋白的定量,目标蛋白为核蛋白时就选择合适的核蛋白内参。一般我们常用的核内参抗体为Lamin ALamin BHistone H3,另外多见于文献的核蛋白内参还有PCNAK70K80Erk2TATA binding protein(TBP)以及c-Junc-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测,常用的内参抗体为Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测,常用VDAC1COX IV作为内参抗体

4.样本处理对于内参表达的影响

有实验数据表明部分管家基因的表达量会收到实验处理影响,常见实验处理如诱导后样本或者是磷酸化、乙酰化等修饰性抗体,尽量选择GAPDH等这类变化不大比较稳定的内参

 

内参中的三大

谈到内参蛋白,我们不得不提到实验室最常见的三大金刚,β-actin42KDa)、β-tubulin50KDa)、GAPDH37KDa

PS:其实你们只是想知道它的分子量而已~~哈哈哈

β-actin,肌动蛋白

β-actin,即肌动蛋白,广泛分布于细胞浆内,表达量非常丰富,其含量占所有细胞总蛋白的50%。但也有特殊情况,比方脂肪组织或细胞内,β-Actin的表达量就很少

 

β-tubulin,微管蛋白,细胞骨架蛋白

作为内参抗体,β-Tubulin表达通常很稳定,是最常见的内参蛋白之一,由于其稳定的性质也常被用于免疫荧光(Immunofluorescence, IF)中观察细胞的微管结构